[发明专利]一种快速制备人玻璃粘连蛋白的方法及应用在审
申请号: | 202010306886.8 | 申请日: | 2020-04-17 |
公开(公告)号: | CN111499728A | 公开(公告)日: | 2020-08-07 |
发明(设计)人: | 不公告发明人 | 申请(专利权)人: | 安徽中盛溯源生物科技有限公司 |
主分类号: | C07K14/78 | 分类号: | C07K14/78;C07K1/22;C12N5/074;C12N5/079 |
代理公司: | 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 | 代理人: | 陆惠中;田欢 |
地址: | 230088 安徽省合肥市高*** | 国省代码: | 安徽;34 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 快速 制备 玻璃 粘连 蛋白 方法 应用 | ||
1.一种玻璃粘连蛋白的制备方法,其特征在于,依次包括如下步骤:
S1:细菌培养;
S2:得到包涵体;
S3:亲和层析;
S4:清洗杂蛋白后柱上复性;
S5:清洗细菌内毒素;
S6:洗脱步骤,得到玻璃粘连蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在S2中,将S1培养得到的细菌通过超声破碎,得到包涵体。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在S3中,包括:
S31:用水洗肝素琼脂糖柱后用变性剂缓冲液对肝素琼脂糖柱进行平衡,肝素琼脂糖柱平衡好后备用;
S32:将包涵体用变性缓冲液溶解后,离心去沉淀,得到上清液;
S33:将上清液与肝素琼脂糖凝胶混合得到混合液,将混合液过S31中的已平衡的肝素琼脂糖柱,得到流穿样品。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在S4中,包括:
S41:用变性剂缓冲液洗去未结合的玻璃粘连蛋白和其他杂蛋白,洗至OD280nm≤0.02mg/ml为止;
S42:再柱上梯度洗去变性剂,使得玻璃粘连蛋白复性。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,在S41中,所述变性剂缓冲液包含氯化钠;优选的,所述氯化钠的浓度为25-200mM。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,在S42中,设置4~5个洗涤梯度依次去除变性剂,每个梯度设置10~15个柱体积,过柱流速为2ml/min。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在S5中,包括:使用去污剂柱上去除细菌内毒素;所述去污剂选自C7BzO、Triton X-114、lgepal CA-630、异丙醇、1,2-己二醇、ASB-14或CHAPS中的一种或任意组合。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,采用氯化钠溶液进行洗脱,实时监测OD280nm值变化,当浓度小于0.3mg/ml时,停止收样。
9.据权利要求1所述的方法,其特征在于,在S2和S3之间还包括如下步骤:
将上述获得的包涵体用包涵体清洗液Ⅰ和包涵体清洗液Ⅱ分别清洗一次;所述包涵体清洗液Ⅰ包括Tris-Hcl(pH8.5)10mM-50mM,NaCl450-650mM,Urea120g-240g,EDTA5mM-10mM,DTT5mM-10mM,CA-6300.1%-1%;包涵体清洗液Ⅱ包括Tris-Hcl(pH8.5)10mM-50mM,NaCl50-100mM,Urea120g-240g,EDTA5mM-10mM,DTT5mM-10mM。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法得到的玻璃粘连蛋白。
11.一种大规模培养细胞的方法,其特征在于,使用权利要求10所述的玻璃粘连蛋白包被细胞培养材料;优选的,所述细胞为人多能干细胞和神经前体细胞。
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