[发明专利]一种快速制备人玻璃粘连蛋白的方法及应用

说明书

本发明涉及生物领域，具体涉及一种快速制备人玻璃粘连蛋白的方法及应用。本发明公开了一种玻璃粘连蛋白的制备方法，依次包括如下步骤：S1：细菌培养；S2：得到包涵体；S3：亲和层析；S4：清洗杂蛋白后柱上复性；S5：清洗细菌内毒素；S6：洗脱步骤，得到玻璃粘连蛋白。通过在柱上对目标蛋白进行复性与去内毒素，大大的提高了制备高活性玻璃粘连蛋白的效率，提高了玻璃粘性蛋白的产量，且得到的玻璃粘连蛋白含有的内毒素含量低，符合临床上的生产和使用标准。此外，制备得到的玻璃粘连蛋白可用于包被细胞培养材料，用于促进细胞的生长和定向分化。

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种快速制备人玻璃粘连蛋白的方法及应用。

背景技术

玻璃粘连蛋白(vitronectin，VTN)是一种存在于血浆和各种组织中丰富的黏附性糖蛋白。与纤连蛋白相同，VTN是血浆中主要的细胞粘附蛋白之一，在血管生成、止血、血栓形成、伤口修复、以及先天免疫，特别是与补体调节、白细胞募集或细菌趋向性等方面起到重要的调节作用。VTN可以与细胞表面受体(如整合素αvβ1、αvβ3、αvβ5)相结合，促进细胞的黏附与伸展；可以与细胞表面糖胺聚糖结合，从而抑制终末细胞裂解补体系统的膜损伤作用。而丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPIN)(如纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)-1)与VTN的结合可以抑制VTN与细胞的结合。目前VTN及其衍生物(人血来源或重组蛋白)作为细胞基质，在体外细胞培养中有着广泛的应用。

人糖基化形式的VTN(含459氨基酸)的分子质量为75到78kDa，有单链形式和带有二硫键的双链(65kDa和10到12kDa)形式。成熟的VTN在功能上由几个部分组成，它们在蛋白序列上的独特结合域之间相互作用，主要集中在蛋白的氨基端(N端)和羧基端(C端)。从N端开始，有“生长调节素-B”(SMB)域的Arg-Gly-Asp(RGD)粘附位点，其可与特定的细胞表面受体相互作用。后面相邻的是酸性抗原决定基(由于硫酸盐化作用和磷酸化位点)结合位点的高分子量激肽原(High MW Kininogen)，在C端附近是一个12kDa富含精氨酸的区域，当VTN在体内与凝血酶-抗凝血酶III复合物结合时或在体外用尿素处理变性时，此区域能与肝素结合。

商业化人血来源的全长VTN蛋白与哺乳动物细胞蛋白表达系统提纯的VTN重组蛋白价格昂贵，不利于VTN的规模化应用。而细菌蛋白表达系统提纯的VTN重组蛋白也已证明其可以做为细胞基质成功应用于体外细胞的培养，如人多能干细胞(hPSC)包括人胚胎干细胞(hESC)，人诱导多能干细胞(hiPSC)的培养等。目前已有的研究均报道了该蛋白表达要复杂的透析复性过程才有生物学活性，但复性的方法繁杂，且复性率低，内毒素污染等问题局限了该蛋白的量产与其在临床级细胞生产中的应用。

现有文献报道利用大肠杆菌表达的重组人VTN，表达形式均为包涵体。例如文献1：全长VTN在大肠杆菌中的表达、生产及特性研究；文献2：低内毒素重组人VTN的表达、纯化及生物活性分析；文献3：基于重组蛋白VTN作为多能干细胞向肝样细胞分化的基质的设计。但现有的这些技术存在或多或少的问题。