[发明专利]一种副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株、筛选方法及用途

权利要求书

1.一种副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法，其特征在于，所述副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法包括以下步骤：

步骤一，初筛：将待筛乳杆菌选菌株放入盛有初筛培养基的培养皿中，并将培养皿放入30～35℃的恒温摇床中培养4～5天；

步骤二，接种培养：将经过初筛培养后得到的乳杆菌接种至新鲜牛奶中，并置于30～35℃的生化培养箱中发酵培养3～4天，获得发酵组合物；

步骤三，活性检测：将发酵组合物挑取划线分离，以大肠杆菌为指示菌，对得到的单菌落进行抑菌活性试验检测；

步骤四，将通过活性检测的单菌落放至初筛培养基中，摇床培养8～10天；取2ml培养后的菌液置于放有厌氧培养基的厌氧瓶中培养25～30天；

步骤五，将厌氧瓶放至30℃厌氧培养罐中培养20天，在培养的过程中持续充入氮气，得到具有良好抗菌活性的副干酪乳杆菌坚韧亚种FX-6-1菌株。

2.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法，其特征在于，步骤一中，所述初筛培养基的制备方法为：

(1)按质量份数将Na₂S₂O₃ 10～15份、KNO₃ 8～12份、(NH₄)₂HPO₄ 5～7份、半胱氨酸1～2份进行混合，得到混合液；

(2)在混合液中加入5％碱性复红乙醇溶液，调节pH值为7.2-7.4；

(3)设定加热温度为120～125℃，加热时间为15～20min灭菌；

(4)在室温下进行冷却，然后加入维生素营养液15～20份，搅拌均匀，得到初筛培养基。

3.如权利要求2所述的副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法，其特征在于，所述维生素营养液中硫胺素为0.12～0.15μg/L、吡哆醇为0.13～0.16μg/L、泛酸钙为0.15～0.2μg/L、硫酸锌3～5mg/L和烟酸为0.11～0.13μg/L。

4.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法，其特征在于，步骤一中，所述恒温摇床的转速为180～190rpm/min。

5.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法，其特征在于，步骤三中，对得到的单菌落进行抑菌活性试验检测包括：

(1)使用Φ90的平板配制培养基25ml，琼脂的加量为0.75％；

(2)对培养基进行120-150℃灭菌5min，放到50℃恒温水浴锅中，降温至50℃；

(3)加入大肠杆菌，混匀后倒平板；

(4)培养基凝固后用6mm的打孔器打孔，将标样和检测的样品分别加入到不同的孔内；

(5)低温扩散3-8小时后，正放培养箱内培养，根据抑菌圈的直径进行抑菌活性计算。

6.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法，其特征在于，步骤四中，所述摇床培养的温度为30～35℃、摇床转速为180～185转/min。

7.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法，其特征在于，步骤四中，所述厌氧培养基按质量份数由15～17份MnSO₄、10～12份Na₂S₂O₃、5～8份KH₂HPO₄、3～5份NH₄Cl、1.5～2份CaCl₂和0.5～1份FeCl₃混合后煮沸晾凉，调pH至中性，然后加1～1.2ml指示剂，充N₂装瓶，经过120～125℃，20～25min的灭菌得到。

8.如权利要求7所述的副干酪乳杆菌坚韧亚种菌株的筛选方法，其特征在于，所述指示剂为美兰厌氧指示剂。