[发明专利]化学耐受性的葡萄糖脱氢酶突变体及其在辅酶再生中的应用

说明书

本发明涉及化学耐受性的葡萄糖脱氢酶突变体及其在辅酶再生中的应用，属于生物工程技术领域。本发明提供了巨大芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶突变体，其编码基因、含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，突变体酶制剂的制备方法，以及该突变体酶制剂在氧化还原反应中参与辅酶NAD(P)H再生的实际应用。本发明得到了热稳定性和化学耐受性均显著提升的突变体，满足了工业应用的需求。本发明所述突变体不仅具有高的活性和热稳定性，而且还具有很好的化学耐受性，将更有助于含高浓度有机助溶剂或高浓度底物/产物的生物催化反应体系中的辅酶再生，在工业应用中显示出更加广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及化学耐受性的葡萄糖脱氢酶突变体，其编码核酸，含有该核酸序列的重组表达载体和重组表达转化体，突变体酶制剂的制备方法，以及该突变体酶制剂在氧化还原反应中参与辅酶再生中的应用。

背景技术

葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase,GDH)是用于辅酶再生的一类重要工具酶。它能催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，同时将产生的氢负离子与电子受体NAD⁺或NADP⁺结合，生成还原型辅酶NADH或NADPH，从而实现还原型辅酶的循环再生。葡萄糖脱氢酶催化辅酶再生具有以下优点：(1)酶催化效率高；(2)双辅酶再生(NADH和NADPH)，(3)所使用的底物葡萄糖廉价易得；(4)对于NAD(P)⁺的K_m较小，即与辅酶的亲和力大；(5)反应不可逆。上述的这些优点使得葡萄糖脱氢酶在辅酶再生的领域具有广泛的应用前景及潜力。为了满足工业应用日益增长的需求，从巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中克隆获得了多种葡萄糖脱氢酶并于大肠杆菌中重组表达。并且已经详细研究了来自巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶的特征。

在应用方面，Makino等人对来源于Bacillus megaterium IWG3的葡萄糖脱氢酶进行了化学诱变，得到了四株热稳定性提高的突变体E96A、E96G、Q252L和Y253C，其中E96A最稳定，与母本相比，热稳定性提高了大约20℃(FEBS Lett.,1989,253:113-116)。Baik等人将来源于Bacillus licheniformis IFO12200，Bacillus megaterium IFO 15308，Bacillus subtilis IFO 13719和来源于Bacillus megaterium IWG3的葡萄糖脱氢酶突变体Q252L通过DNA shuffling得到了一个热稳定性进一步提高的突变体Q252L/E170K(Appl.Environ.Microbiol.,2005,71:3285-3293)。通过上述分子改造，使得高活性天然葡萄糖脱氢酶突破了热稳定性差的瓶颈，从而使其在工业应用中具有更大的竞争优势。

葡萄糖脱氢酶作为一种性能优良的辅酶再生工具酶，因其良好的催化活性和热稳定性，已经基本满足了大部分的实际应用需求。但在大规模工业应用中，催化体系中常常存在高浓度的疏水性底物或产物，导致葡萄糖脱氢酶快速失活，限制了其广泛应用。酶在高浓度疏水性底物或产物中的稳定性，通常称为化学耐受性或化学稳定性，类似于有机溶剂的耐受性。Ding等人发现来源于Lactobacillus salivarius的葡萄糖脱氢酶LsGDH在与水互溶的有机溶剂和双相溶剂系统中都表现出了较高的化学稳定性，但在正丁醇中却展现出很差的化学耐受性，使用10％(v/v)的正丁醇处理后，其活性几乎完全丧失(Bioresour.Technol.,2011,102:1528-1536)。研究人员也在酶有机溶剂耐受性方面做了大量改造工作，其中利用蛋白质工程来提高酶的有机溶剂耐受性已成为比较成熟的方法。酶工程的方法集中于改变蛋白质分子的一级序列，以产生在有机介质中具有优异稳定性和活性的酶突变体。但是，目前针对葡萄糖脱氢酶对于高浓度底物耐受性的改造工作还未见报道。通过定向进化等蛋白质工程技术对其结构进行分子改造，提高其化学稳定性及在高浓度化学品转化体系中的辅酶再生能力，有助于进一步降低酶催化生产成本、推动生物催化在医药、农药、材料、能源等领域中的更广泛应用。

发明内容