[发明专利]一种无血清低DMSO细胞冻存液及其应用

说明书

本发明提供一种无血清低DMSO细胞冻存液及其应用。具体地说，本发明提供了一种无血清细胞冻存液或试剂盒，包含如下组分或者由如下组分组成：无血清细胞培养基、二甲基亚砜、甘露糖、山梨醇、氨基酸等组分。本发明还涉及采用所述试剂盒配制所述冻存液的方法以及采用所述冻存液冻存细胞的方法。本发明细胞冻存液不含任何血清和其它蛋白，极大避免了细胞保存过程中的污染风险；而且含有很低浓度的DMSO，极大降低了对细胞潜在的毒性作用。本发明的冻存液冻存效果好，细胞冻存1个月后存活率甚至可达到95％以上；不需要程序降温，操作简单，可原位冻存细胞，广泛用于各种动物细胞、杂交瘤细胞及人细胞株的冷冻保存。

技术领域

本发明涉及生命科学细胞培养及保存技术领域，尤其涉及无血清低DMSO快速细胞冻存液及其制备方法和应用。

背景技术

细胞培养技术创建于二十世纪初，历经一个多世纪的发展，现在已成为生命科学领域越来越重要的实验技术之一。由于细胞的特殊性，在细胞培养过程中，或在细胞建株和建系过程中，随着传代次数的增加，细胞的各种生物特性都会逐渐发生变化。因此，原始细胞种子的及时保存就显得尤为必要。在杂交瘤单抗的制备过程中，杂交瘤细胞以及克隆化得到的亚克隆细胞的冻存，是必不可少的操作。因为在没有建立一个稳定的细胞系或稳定分泌抗体的细胞系的时候，在细胞的培养过程中随时可能因细胞的污染、分泌抗体能力的丧失或遗传变异等等缘故而导致实验失败，如果没有原始细胞的冻存，则将因为上述的意外而前功尽弃。除此之外，购买、交换和运送某些细胞也需要利用细胞冻存的形式来进行。因此，及时方便地进行细胞的冻存在实际工作中显得十分必要。

目前，最成熟和最稳定的冻存细胞技术是将加有保护剂的细胞悬液置于-196℃液氮中，这样可以使细胞暂时脱离生长状态而保持细胞的特性，在需要的时候经过复苏程序，使得细胞重新生长增殖以用于实验。细胞储存在-196℃液氮中，理论上储存时间是无限的。

细胞在冷冻过程中，特别需要防止溶液结冰对细胞的破坏，从而导致细胞不可逆的失活。1972年，Mazur等人根据对中国仓鼠组织培养细胞的低温保存实验数据分析，提出冷冻损伤的两因素假说，即冰晶损伤假说和溶液损伤假说。

冰晶损伤假说认为随着温度的下降，细胞内外的水分结冰形成的冰晶会破坏细胞膜和细胞器，从而引起细胞死亡。这种因细胞内水分结冰而导致的细胞损伤即就是冰晶损伤(Intracellular ice damage)。一般认为，冰晶损伤是由于冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。

溶液损伤假说认为随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，细胞膜上的脂质会因长时间暴露在高浓度溶质的溶液中而受到损坏，细胞发生渗漏，导致在细胞复苏时短时间内大量水分渗入细胞内而造成细胞死亡。这种因溶液中溶质浓度增高而导致的细胞损伤被称为溶液损伤(Solution damage)。溶液损伤是由于冷冻速度过慢，使细胞在高浓度溶质的溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，损伤越严重。

因此，目前细胞冻存及复苏的基本原则普遍遵循的是慢冻快融的方式，实践证明这样可以最大限度的保存细胞活力。但是，无论采用什么方式冻存细胞，都必须加入一种或多种保护剂类物质，以避免细胞以上述两种假说中所描述的方式致使结构受到破坏而死亡。

目前，细胞冻存要取得好的效果，多采用血清、甘油或二甲基亚砜(DMSO)等作为保护剂。这些物质有些能提高细胞膜对水的通透性，在缓慢冷冻过程中可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。同时，有些保护剂在细胞外也能减轻溶液中高浓度溶质对细胞的损伤，进一步避免细胞在冷冻和复苏过程中受到损伤。