[发明专利]一种含外泌体的软骨修复材料的制备方法

权利要求书

1.一种含外泌体的软骨修复材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)外泌体的制备：

步骤一：利用基因工程手段构建miRNA140过表达的质粒；

步骤二：借用慢病毒载体，包装后转染293T；

步骤三：侵染骨髓充间质干细胞；

步骤四：培养hBMMSC-140，从培养基中分离过表达miRNA-140的外泌体Exso-140，添加含葡萄糖酸钠和无机盐的保存液，-80℃保存；

(2)支架材料的制备：称取Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原，按照0.01-30:70-99.9(W/W)比例分散在醋酸溶液中，搅拌混合至体系均匀，并加入NaH₂PO₄继续搅拌若干小时后，用氨水调pH至10.0，缓慢加入Ca(NO₃)₂继续反应12h，反应结束后过滤，并将沉淀反复水洗后，放置于容器中；

(3)复合材料的制备：将处理后的支架材料置于外泌体Exso-140的保存液中，负压吸引脱气1-4h，冰水浴中继续吸收2h，使支架能够充分吸收外泌体，再将浸泡后的支架材料置于容器中，-80℃超低温冰箱中预冷冻4-24h，-50℃冷冻干燥机中冷冻干燥24-48h，获得含有外泌体的活性软骨修复材料；

(4)成型：将(3)中干燥的活性骨架修复材料置于液氮研磨机中，研磨成粉。

2.根据权利要求1所述的一种含外泌体的软骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述外泌体的制备步骤一以慢病毒表达载体为基础，整合miRNA-140基因，得到miRNA-140过表达慢病毒载体。

3.根据权利要求2所述的一种含外泌体的软骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述的载体包括pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-140、pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato-140及pCDF1-MCS2-EF1-copGFP-140之一。

4.根据权利要求1所述的一种含外泌体的软骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述外泌体的制备步骤二使用慢病毒包装质粒，转染293T细胞，富集高滴度的病毒液。

5.根据权利要求4所述的一种含外泌体的软骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述的质粒包括pSPAX2和pMD2.G。