[发明专利]一种含外泌体的软骨修复材料的制备方法

说明书

本发明涉及一种含外泌体的软骨修复材料的制备方法，包括外泌体的制备、支架材料的制备及复合材料的制备，其中外泌体的制备包括步骤一：利用基因工程手段构建miRNA140过表达的质粒；步骤二：包装获得慢病毒，转染293T；步骤三：侵染充间质干细胞；步骤四：培养hBMMSC‑140，从培养基中分离过表达miRNA‑140的外泌体Exso‑140，添加含葡萄糖酸钠和无机盐的保存液，‑80℃保存。旨在制备一种双组分胶原与羟基磷灰石为基元的仿生软骨支架材料，将外泌体有效的包埋其中，保持其原有活性，形成一种具有活性的功能性软骨修复材料，不仅能对成骨细胞增殖起到作用，而且可以修复血管损伤，增强仿生骨材料的功能性。

技术领域

本发明属于组织工程学领域，涉及软骨修复材料技术，尤其是一种含外泌体的软骨修复材料的制备方法。

背景技术

关节软骨表面光滑，具有弹性，能最大限度地吸收、缓冲应力作用，能减少相邻两骨的摩擦，缓冲运动时产生的震动。而关节软骨损伤难以自愈，目前的治疗手段主要有软骨移植和金属材料或者高分子材料的关节假体置换，而两种方法在临床应用上都各自存在来源有限和置换术后松动等问题。

近年来，随着细胞生物学和生物材料科学的发展，组织工程学应运而生，它是利用生命科学和工程的原理和方法，以人工合成材料为载体整合被分离细胞，形成新的有功能组织。骨修复材料的发展是骨组织工程的一个重要方面，随着各种新型材料的出现，丰富了大家对骨损伤修复的认识和方法，研发真正的生物活性人工骨最直接的途径就是模仿天然骨的结构，合成一种与骨有相似纳米结构、组成成分和生物学反应的材料。

其中软骨工程包括：(1)种子细胞(2)支架材料(3)合适的培养环境，细胞因子的作用。自体软骨细胞分离培养简单，同源性好，但其来源非常有限，不能满足治疗的需求，而且体外多次培养容易产生表型转换，表达Ⅰ型胶原为主，丧失分泌软骨基质的功能，极大限制了其作为种子细胞的应用前景。

通过对成骨机理和骨基元微观结构的深入研究，人们已经认识到自然软骨微观结构是由纳米羟基磷灰石晶须和Ⅰ型、Ⅱ型胶原纤维通过特定的排列和化学键的连接组成基本单元。目前的软骨修复材料基本采用Ⅱ型胶原作为有机基质，通过原位析晶方法构建三维立体结构，从而获得软骨修复材料，或者是采用添加生长因子的方式构建软骨材料。

构建的软骨材料不仅在成分上与自然软骨相似，同时构造的三维构型可以满足生长增殖迁移的三维场所，提供细胞足够的生长空间，但是现有的胶原构建的骨材料仅仅是可以促进成骨细胞增殖，对血管没有修复作用，而添加的生长因子也存在易失活，不易保存的问题。

人类miRNA-140定位于人的第16号染色体的短臂上，其靶目标主要有胰岛素样生长因子结合蛋白-5(IGFBP-5)和去整合素金属蛋白酶-5(ADAMT-5)等。miRNA140在软骨细胞中特异高表达。近年来的研究发现，miRNA-140在参与软骨细胞分化与骨关节炎(OA)的发病机制中扮演重要角色。OA是软骨退变所致疾病的典型代表。在OA病人的软骨细胞中，miR140表达显著下调，MMP13和IGFBP-5表达显著增高。在软骨细胞中转染miRNA140可对抗这些改变。

外泌体是细胞之间的信号传递因子，它广泛存在并分布于各种体液中，携带多种蛋白质、mRNA、miRNA和脂质类物质等。生物体的外泌体形成了一种全新的细胞-细胞间信息传递网络，可参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程。利用外泌体递送miRNA140治疗软骨缺损具备坚实的理论支撑。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种含外泌体的软骨修复材料的制备方法，旨在制备一种双组分胶原与羟基磷灰石为基元的仿生软骨支架材料，将外泌体有效的包埋其中，保持其原有活性，形成一种具有活性的功能性软骨修复材料，不仅能对成骨细胞增殖起到作用，而且可以修复血管损伤，增强仿生骨材料的功能性。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：