[发明专利]一种新型真皮基质脱细胞方法

说明书

本发明涉及一种新型真皮基质脱细胞方法，全程采用含有结构稳定剂的溶液处理真皮，包括脱细胞前的浸泡、组织脱细胞、脱细胞后的清洗，包括⑴将真皮基质置于含结构稳定剂的PBS缓冲液中，2‑8℃，200‑500Pa低压浸泡20min‑2h；⑵将真皮基质置于含有结构稳定剂的脱细胞溶液中，2‑8℃，80‑200rpm震荡处理4‑6h；⑶将真皮基质置于含有结构稳定剂的脱细胞溶液中，2‑4℃，超声高压处理30‑60min；超声功率20‑40Hz，压强为200‑500MPa。结构稳定剂包括丝素蛋白、甘露醇、甘氨酸、精氨酸、蔗糖中的两种或三种。本发明的脱细胞方法制备的真皮基质，外观更为柔软有韧性，且热稳定性、机械性能和生物活性成分保留量均有所提高，增加了材料的亲水性和细胞亲和性，能够诱导细胞长入。

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，涉及真皮基质脱细胞技术，尤其是一种新型真皮基质脱细胞方法。

背景技术

皮肤由表皮层、真皮层和皮下组织构成，真皮层是一层致密结缔组织，组成成分有胶原纤维、成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、血管等。胶原纤维主要是由Ⅰ型胶原蛋白构成，种属间差异很小，而外源细胞、组织液、核酸、脂质是引起免疫原性的因素。真皮基质作为外源组织植入人体时，需要去除细胞、核酸等上述因素才能避免出现免疫排斥反应。真皮基质可来自异体皮、猪皮、牛皮、羊皮等。

目前常用的脱细胞方法有物理法(如搅拌、震荡、超声、低渗和高渗)、化学法(如酸、碱、表面活性剂)、酶法(如胰蛋白酶、DNase等)、有机溶剂(如乙醇、丙酮等)，这四种方法处理过程中都会造成真皮基质结构不同程度的损伤，降解基质中的活性因子，导致材料机械性能降低、热稳定性差、生物相容性差。因此在动物真皮脱细胞过程中，如何高效去除免疫原性，同时最大化维持真皮基质三维结构稳定性和保留蛋白聚糖、生长因子等生物活性成分，是当前的技术难点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种在脱细胞过程中有效避免真皮基质结构损伤、确保其机械性能高、热稳定性及生物相容性高的新型真皮基质脱细胞方法。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种新型真皮基质脱细胞方法，包括以下步骤：

⑴脱细胞前结构稳定剂的浸泡：

a含结构稳定剂的PBS缓冲液的配制：将PBS溶液与结构稳定剂室温100-150rpm震荡混匀5-15min；

b将真皮基质置于上述步骤a配置的混合液中，2-8℃，低压浸泡20min-2h，低压压力为：200-500Pa，浸泡比例为溶液体积：真皮基质湿重＝1-3:1(w/v)；

⑵脱细胞过程：

a含有结构稳定剂的脱细胞溶液的配制：将脱细胞溶液与结构稳定剂室温80-200rpm震荡混匀15-30min；

b将真皮基质置于上述⑵a配制的脱细胞混合液中，2-8℃，80-200rpm震荡处理4-6h，处理比例为混合液体积：真皮基质湿重＝5-10:1(w/v)；

c将步骤⑵b处理后的真皮基质置于⑵a配制的脱细胞溶液中，2-4℃，超声高压处理30-60min，超声功率20-40Hz，压强为200-500Mpa，处理比例为混合液体积：真皮基质湿重＝1-3:1(w/v)；

⑶等渗清洗：将真皮基质置于⑴a配制的含有结构稳定剂的PBS缓冲液中，2-8℃，80-150rpm震荡处理24-48h，处理比例为混合液体积：真皮基质湿重＝10-20:1(w/v)。

而且，所述的结构稳定剂为丝素蛋白、甘露醇、甘氨酸、精氨酸、蔗糖中的两种或三种。

而且，所述结构稳定剂组分的质量浓度为：

丝素蛋白：5％-20％