[发明专利]重组仙台病毒的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种将PBMC重编程为iPS细胞的方法，其特征在于，接种并培养PBMC细胞，在所述PBMC细胞中加入重组仙台病毒Sev-p53DD-Myc和Sev-KOS，继续培养，将所述PBMC细胞感染并重编程为iPS细胞，

所述重组仙台病毒的构建方法包括：

提供pCAGGS线性化载体、NP基因、P基因和L基因，将NP基因、P基因和L基因分别与pCAGGS线性化载体融合，构建质粒pCAGGS-NP、pCAGGS-P和pCAGGS-L；

以仙台病毒逆转录样品为模板，使用高保真DNA聚合酶Phanta EVO分别采用第一引物对和第二引物对进行PCR扩增，获得仙台基因组SeV-01DNA片段和SeV-02DNA片段；在pUC57-Simple中插入第一序列，获得pUC57-inser质粒，采用EcoRI-HF酶切后获得线性化pUC57-insert质粒；采用第三引物对对线性化pUC57-insert质粒扩增，获得pUC-insert DNA；将SeV-01DNA片段、SeV-02DNA片段和pUC-insert DNA融合，获得Sev-full质粒；

在pUC57-Simple中插入表达功能性基团A的第二序列，获得pUC57-A质粒，NotI-HF限制性内切酶酶切后，收集A-Not1酶切片段；使用NotI-HF限制性内切酶对Sev-full质粒酶切处理，收集Sev-full-Not1酶切片段；将A-Not1酶切片段和Sev-full-Not1酶切片段连接，得到Sev-A质粒，所述基因A选自KOS和p53DD-Myc；

提供293T细胞，接种、培养；转染前将培养基换液为Opti-MEM培养基，然后加入所述质粒pCAGGS-NP、pCAGGS-P、pCAGGS-L、Sev-A质粒和T7-opt质粒，而后进行增殖培养，得到重组仙台病毒，所述增殖培养采用无血清培养基；所述无血清培养基为添加有重组胰蛋白酶和胎牛血清替代物的高糖DMED培养基；

其中，所述重组仙台病毒中的L基因包含Y942H突变；

所述第一引物对包括：

NP-for：ATGGCCGGGTTGTTGAGCAC；

HN_up-rev:TTGGCATCCTCGGGTCCTACA；

和所述第二引物对包括：

HN_down-for：GTAGGACCCGAGGATGCCAAC；

Trailer-rev：

TTTAAGAGATATGTATCCTATTAAATTTTCTTGTCTTCTTGTAAG；

和所述第三引物对包括：

pUC-for：TAGGATACATATCTCTTAAACTCTTGTCTGGTGGCC；

pUC-rev：GTGCTCAACAACCCGGCCATC；

所述第一序列为：

ACGCGTTAATACGACTCACTATAGGGAGATTGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGGAGTCTAGACTCCGTCACCAAACAAGAGAAAAAACATGTATGGGATATACAATGAAGTTAGACAGGATTTTAGGGTCAAAGTATCCACCCTGAGGAGCAGGTTCCAGACCCTTTGCTTTGCTGCCAAAGTTCACGCGGCCGCAGATCTTCACGATGGCCGGGTTGTTGAGCACGAATTCTAGGATACATATCTCTTAAACTCTTGTCTGGTGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCCGAGGGGACCGTCCCCTCGGTAATGGCGAATGGGACCCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATGGGCCC。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入所述质粒pCAGGS-NP、pCAGGS-P、pCAGGS-L、质粒Sev-A和T7-opt的步骤中，采用lipo3000作为转染试剂。

3.如权利要求1所述的的方法，其特征在于，在所述PBMC细胞中加入所述重组仙台病毒溶液的步骤中，所述重组仙台病毒溶液的滴度为3MOI～10MOI。