[发明专利]重组仙台病毒的构建方法及其应用

说明书

本发明提供一种重组仙台病毒的构建方法，包括：构建质粒pCAGGS‑NP/P/L；以仙台病毒逆转录样品为模板扩增SeV‑01/02 DNA；扩增线性化pUC57‑insert质粒收集pUC‑insert DNA；将SeV‑01/02 DNA片段和pUC‑insert DNA融合，获得Sev‑full质粒，酶切得到Sev‑full‑Not1；合成pUC57‑A质粒，酶切收集A‑Not1，与Sev‑full‑Not1连接得到Sev‑A质粒；提供293T细胞，加入pCAGGS‑NP/P/L、Sev‑A和T7‑opt三种质粒，转染得到重组仙台病毒。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种重组仙台病毒的构建方法，一种用于将PBMC重编程为iPS的试剂盒，以及一种将PBMC重编程为iPS细胞的方法。

背景技术

仙台病毒(SeV)，也称为1型副流感病毒或HVJ(Hemagglutinating Virus ofJapan，日本血凝病毒)，是副粘病毒科的一种负链单股单链RNA病毒。仙台病毒具有以下特征：(1)仙台病毒的生命周期中，病毒蛋白和基因组均在细胞质内，病毒基因组不与细胞基因组进行整合；(2)仙台病毒能够在细胞全生命周期内进行感染，能够以极高的效率感染大多数细胞，包括慢病毒难以感染的细胞类型；(3)表达外源基因高效并且可调控，在体内和体外实验中均可以检测到高表达的目的基因。由于具有上述特征，仙台病毒能够通过反向遗传学的开发，成功地进行重组改造，以表达相应的外源基因，同时不会将基因重组引入宿主细胞基因组。因此，仙台病毒作为一种高效的基因转导工具被广泛研究。

山中伸弥(Shinya Yamanaka)和高桥和利(Kazutoshi Takahashi)在2006年8月报道了将小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)细胞重编程为诱导性多能干(iPS)细胞。该方法使用逆转录病毒进行基因导入操作，在病毒转基因进入细胞基因组时容易造成致癌风险。目前，科学家们已经开发了数种方法用于细胞重编程诱导产生iPS细胞，包括腺病毒载体和转座子替代方法，依然存在病毒整合风险。使用质粒DNA转染或小分子诱导生成iPS细胞，由于蛋白表达水平较低，因此重编程效率低下。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组仙台病毒的构建方法，旨在解决细胞重编程诱导产生iPS细胞的方法，重编程效率低，且包装病毒纯度中容易引入其他活性病毒的问题的问题。

本发明的另一目的在于提供一种采用上述方法制备的重组仙台病毒将PBMC重编程为iPS的试剂盒和方法。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种重组仙台病毒的构建方法，包括以下步骤：

提供pCAGGS线性化载体、NP基因、P基因和L基因，将NP基因、P基因和L基因分别与pCAGGS线性化载体融合，构建质粒pCAGGS-NP、质粒pCAGGS-P和质粒pCAGGS-L；

以仙台病毒逆转录样品为模板，使用高保真DNA聚合酶Phanta EVO分别采用第一引物对和第二引物对进行PCR扩增，获得仙台基因组SeV-01 DNA片段和SeV-02 DNA片段；在pUC57-Simple中插入第一序列，获得pUC57-inser质粒，采用EcorI-HF酶切后获得线性化pUC57-insert质粒；采用第三引物对对线性化pUC57-insert质粒扩增，获得pUC-insertDNA；将SeV-01 DNA片段、SeV-02 DNA片段和pUC-insert DNA融合，获得Sev-full质粒；

在pUC57-Simple中插入表达功能性基团A的第二序列，获得pUC57-A质粒，NotI-HF限制性内切酶酶切后，收集A-Not1酶切片段；使用NotI-HF限制性内切酶对Sev-full质粒酶切处理，收集Sev-full-Not1酶切片段；将A-Not1酶切片段和Sev-full-Not1酶切片段连接，得到Sev-A质粒；