[发明专利]Reg3β/ HMGB1环路调控EAM小鼠巨噬细胞再编程的实验方法

权利要求书

1.一种Reg3β/HMGB1环路调控EAM小鼠巨噬细胞再编程的实验方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)体外研究Reg3β对EAM小鼠心肌浸润巨噬细胞再编程及分泌HMGB1的影响及机制；

步骤(1)包括如下步骤：

(1-1)构建EAM小鼠模型，分离脾脏Ly6C^hi单核细胞和Ly6C^hiF4/80⁺细胞，体外以Reg3β处理；

(1-2)检测细胞表面F4/80、CD206、CD80/86、MHCII、CD11c、SR-A/B、Dectin 1/2的表达，观察ROS、IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-10、TGF-β、AREG、IGF-1、iNOS、Arg1的分泌；

(1-3)研究HMGB1的表达并鉴定其糖基化修饰，从而分析Reg3β对心肌浸润表型、功能再编程及HMGB1分泌的影响；

(1-4)检测PU.1、STAT1/3/6、IRF4/5、ATF3、PPARγ转录因子磷酸化水平，并观察使用相应的转录因子抑制剂或siRNA后对上述表型和功能的影响，研究Reg3β调控心肌浸润巨噬细胞再编程的机制；

(2)体外研究HMGB1对心肌细胞去分化、增殖及Reg3β释放的影响及机制；

步骤(2)包括如下步骤：

(2-1)从无血清培养的上清中经亲和层析分离和鉴定HMGB1，处理出生3-5天小鼠的心肌细胞；

(2-2)检测心肌细胞特异性去分化标志RUNX1、cKIT、DAB2以及细胞内和培养上清中Reg3β的表达，观察细胞增殖能力的变化；

(2-3)分析HMGB1对小鼠心肌细胞去分化、增殖及Reg3β表达的影响；

(2-4)检测信号通路分子ERK1/2、Akt分子的磷酸化情况以及GSK3β/β-catenin的表达，并观察使用相应信号分子拮抗剂或siRNA后对心肌细胞上述去分化标志表达和增殖能力的影响，研究HMGB1调控心肌细胞去分化/增殖的机制；

(3)体内验证Reg3β/N₂-HMGB1环路调控巨噬细胞再编程参与EAM小鼠受损心肌修复的作用和机制；

步骤(3)包括如下步骤：

(3-1)分别构建αMHC-Cre、Reg3βLacZ/flox、CD11b-Cre、HMGB1LacZ/flox BALB/c小鼠，前两者杂交获得Reg3β^-/-BALB/c小鼠，后两者杂交获得HMGB1^-/-BALB/c小鼠；

(3-2)分别在WT、Reg3β^-/-、单核/及HMGB1^-/-BALB/c小鼠基础上诱导EAM模型，21天后采用心脏超声和MRI检测左心室功能；

(3-3)取各组小鼠心脏组织行HE染色和Sirius-red染色分别观察心肌病理改变和纤维化程度，检测心肌细胞RUNX1、cKIT、DAB2特异性去分化标志、Reg3β的表达以及ERK1/2、Akt、GSK3β/β-catenin信号通路的活化情况；

(3-4)观察心肌组织浸润，检测表面F4/80、CD206、CD80/86、MHCII、CD11c、SR-A/B、Dectin 1/2的表达、分泌HMGB1、ROS、IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-10、TGF-β、AREG、IGF-1、iNOS、Arg1的功能、HMGB1的糖基化修饰情况以及PU.1、STAT1/3/6、IRF4/5、ATF3、PPARγ相关转录因子的磷酸化水平变化，从而在体内验证Reg3β/N₂-HMGB1调控巨噬细胞再编程参与EAM小鼠受损心肌修复的作用和机制。