[发明专利]一种提高纳豆芽孢杆菌高效生物合成维生素K2

权利要求书

1.一种提高纳豆芽孢杆菌高效生物合成维生素K₂(MK-7)的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：启动子文库的构建；

步骤2：含不同启动子序列载体的获得；

步骤3：混合质粒的转化；

步骤4：重组菌株荧光强度的检测；

步骤5：同源重组片段的构建；

步骤6：重组P_mytxM启动子纳豆芽孢杆菌的构建；

步骤7：重组P_mgapA启动子纳豆芽孢杆菌的构建；

步骤8：重组P_maroK启动子纳豆芽孢杆菌的构建；

步骤9：利用重组P_ytxM,P_gapA和P_aroK启动子菌株发酵生产维生素K₂(MK-7)。

2.如权利要求1所述的提高纳豆芽孢杆菌高效生物合成维生素K₂(MK-7)的方法，其特征在于，所述步骤1包括随机突变启动子片段获得和融合片段的获得，其中随机突变启动子片段获得包括如下步骤：

以纳豆芽孢杆菌基因组为模板，采用引物ytxMF和ytxMR以及QuicK Mutation基因随机突变试剂盒扩增ytxM基因的上游启动子序列ytxM，得到ytxM不同序列的混合启动子片段PytxM，采用gapAF和gapAR引物用上述方法可以获得PgapA，采用aroKF和aroKR引物用上述方法可以获得aroK不同序列的混合启动子片段ParoK。

3.如权利要求1所述的提高纳豆芽孢杆菌高效生物合成维生素K₂(MK-7)的方法，其特征在于，所述步骤2包括如下步骤：

将含有eGFP的载体pJYW-4采用引物ZTytxMF,ZTytxMR；ZTgapAF,ZgapAR和ZTaroKF，ZTaroKR分别线性化，得到线性化载体片段ZTytxM,ZTgapA，ZTaroK，将载体片段与得到的混合启动子片段分别连接后转化大肠杆菌JM109，提取混合质粒。

4.如权利要求1所述的提高纳豆芽孢杆菌高效生物合成维生素K₂(MK-7)的方法，其特征在于，所述步骤3包括将权利要求2中得到的混合质粒分别转化到纳豆芽孢杆菌感受态细胞中，具体步骤为：

新鲜平板挑单菌落接种于2ml LB培养基中，过夜培养，当其OD₆₀₀＝0.2时转接到50ml的LB培养集中，并加入0.5M山梨醇，37℃、200rpm培养到OD₆₀₀＝1.2；

用冷冻离心机4℃下，7000rpm/min离心5min，将收集的菌体使用预冷的电击缓冲液进行洗涤，再离心，反复三次；

最终使用将菌体用预冷的电击缓冲液悬浮后，分装于1.5ml离心管中，每个离心管中分装50μL感受态细胞，每个感受态细胞中加入质粒浓度为1000～2000ng/μL；

将上述混合好的感受态冰浴孵育5min，加入预冷的电转杯中，电击一次，电转仪设置：0.5～1.0Kv，25μF200Ω，1mm,电击2次，电击完毕立即加入1ml复苏培养基，37℃，200rpm，复苏3h后，涂板，过夜培养；

挑选平板上长出的单菌落，利用引物tyxMYZF，ytxMYZR进行菌落PCR验证，替换后扩增得到的片段长度为800bp，并进行测序。

5.如权利要求1所述的提高纳豆芽孢杆菌高效生物合成维生素K₂(MK-7)的方法，其特征在于，所述步骤4包括如下步骤：

挑取测序正确的菌株各10株，进行96浅孔板培养37℃培养12h，采用酶标仪在523nm处检测每个重组菌株发酵液的荧光强度，提取RNA检测相对转录强度。