[发明专利]一种提高纳豆芽孢杆菌高效生物合成维生素K2

说明书

本发明公开了一种提高纳豆芽孢杆菌高效生物合成维生素K₂(MK‑7)的方法，属于遗传工程技术领域。本发明是采用易错PCR和CRISPR‑Cas9基因编辑技术，通过对维生素K₂(MK‑7)生物合成途径相关基因ytxM、gapA和aroK启动子的突变筛选和整合，构建得到27株重组菌BN3‑1～BN3‑27，筛选得到高产菌，产量达到了133g/l，是原始菌株的的产量的5.78倍，为进一步代谢工程改造纳豆芽孢杆菌生产维生素K₂(MK‑7)奠定了基础。

技术领域

本发明涉及遗传工程技术领域，特别涉及一种提高纳豆芽孢杆菌高效生物合成维生素K₂(MK-7)的方法。

背景技术

维生素K₂(MK-7)[本文中简称MK-7]，又称七烯甲萘醌，英文名称：Menaquinone-7，CAS No.：2124-57-4，是维生素K的活性体之一，是由一个甲基萘醌母环和七个异戊二烯侧链连接而成，是一类重要的脂溶性维生素，是维生素K₂中的一种，MK-7作为γ-谷氨酸羧化酶的辅因子，具有半衰期长，生物利用度好的特点。具有显著的治疗和预防骨质疏松(促进骨矿化、促进骨形成、抑制骨钙流失)，抗动脉钙化及骨关节炎，抗肿瘤，抗氧化、延缓衰老、美肤养颜，治疗肝炎，调整消化道的活动，缓解平滑肌的痉挛，预防肝硬化进展为肝癌，治疗维生素K₂缺乏性出血症，利尿、强肝解毒，降低血压等功效，目前MK-7得到了食品保健、制药行业的广泛关注，具有很高的市场应用价值。

纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)是一种好氧型革兰氏阳性益生菌，属细菌科、芽孢杆菌属，是枯草芽孢杆菌的一个亚种，具有较强的抗逆性，在热、酸碱的条件下能保持其稳定性。纳豆芽孢杆菌可以分解大分子物质生产具有重要用途的氨基酸，有机酸等，自身代谢能分泌多种维生素和消化酶，是生产MK-7优秀的底盘微生物。许静等人利用细菌原生质体电容和技术筛选出维生素K₂突变菌BKU-6，其维生素K₂达到39.6mg/L。Sato等人筛选出一株具有二苯胺抗性的MK-7产生菌MH-1，并以大豆抽提物和甘油为主要营养物质，经过5天的静置培养，最终MK-7产量达到60mg/L。我国对纳豆芽孢杆菌功能特性的研究还处于实验小规模研究阶段，所以开发具有工业化生产的纳豆芽孢杆菌具有重要的意义。

目前合成MK-7的方法有化学合成法和微生物合成法，化学合成的七稀甲萘醌(MK-7)分子中的异戊二烯侧链多为顺式结构，活性和功能具有很大的限制，且副产物多，原料来源受到限制，已经逐步被生物发酵法所替代。微生物合成法主要集中在两种菌株的研究，分别是纳豆芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，但原始的枯草芽孢杆菌的MK-7产量较低(10mg/L)，作为生产MK-7的底盘微生物时，产量提高有局限。而作为从富含MK-7的纳豆中筛选出的纳豆芽孢杆菌作为底盘微生物，其原始菌的MK-7产量较为可观(20mg/L)。因此对纳豆芽孢杆菌进行代谢改造对于提高MK-7的产量具有积极意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高纳豆芽孢杆菌高效生物合成维生素K₂(MK-7)的方法，对纳豆芽孢杆菌进行代谢通路改造，利用随机突变试剂盒对纳豆芽孢杆菌合成MK-7的中的gapA、aroK和ytxM关键基因启动子序列进行突变，进一步提高MK-7的产量，获得和筛选出高产MK-7产量的纳豆芽孢杆菌。经过发酵验证后最终纳豆芽孢杆菌发酵生产七烯甲萘醌在摇瓶培养的产量达到133mg/L，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种提高纳豆芽孢杆菌高效生物合成维生素K₂(MK-7)的方法，包括如下步骤：

步骤1：启动子文库的构建；

步骤2：含不同启动子序列载体的获得；

步骤3：混合质粒的转化；