[发明专利]一种表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法及其应用

说明书

本发明涉及一种表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法及其应用，该方法包括：对hACE2基因进行PCR扩增，并将hACE2基因克隆至pEASY‑T1载体中；从载体pEASY‑T1‑hACE2上将hACE2基因克隆至慢病毒表达载体；将所述重组质粒转染哺乳细胞，以便获得重组慢病毒；将所述重组慢病毒与NK细胞混合，150g室温离心4小时，离心结束后加入培养基培养3‑4天。从而将hACE2基因整合到NK细胞上，使得NK细胞能够持续表达hACE2蛋白胞外段，进而利用带hACE2蛋白胞外段的NK细胞抑制COVID‑19的S‑蛋白进攻正常细胞，抑制COVID‑19病毒的生长，达到预防和治疗的效果。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法及其应用。

背景技术

2019新型冠状病毒(COVID-19)是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法。根据中科院的研究表明，COVID-19与SARS-CoV结合受体方式相似，均通过S-蛋白与hACE2蛋白结合感染细胞。与SARS-CoV相比，COVID-19的S-蛋白中与hACE2蛋白结合的5个关键氨基酸有4个发生了变化，但变化后的氨基酸，却在整体性上完美地维持了SARS-CoV的S-蛋白与hACE2蛋白互作的原结构构象。

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，其与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，但其临床治疗效果有限；而外源型ACE2蛋白的数量有限。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法。该方法通过基因工程改造NK细胞，使NK细胞能够持续表达hACE2蛋白胞外段，从而抑制COVID-19进攻人体细胞，达到预防和治疗的效果。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法，其包括以下步骤：

对hACE2基因进行PCR扩增，并将hACE2基因克隆至pEASY-T1载体中，以便获得载体pEASY-T1-hACE2；

从所述载体pEASY-T1-hACE2上将hACE2基因克隆至慢病毒表达载体pLV-sf GFP(2A)Puro中，以便获得重组质粒pLV-EGFP-hACE2；

将所述重组质粒pLV-EGFP-hACE2转染哺乳细胞，以便获得重组慢病毒；

将所述重组慢病毒与NK细胞混合，150g室温离心4小时，离心结束后加入培养基培养3-4天。

根据本发明的一种表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法，该方法利用慢病毒系统将hACE2基因整合到NK细胞上，使得NK细胞能够持续表达hACE2蛋白胞外段，维持hACE2蛋白数量，从而利用带hACE2蛋白胞外段的NK细胞抑制COVID-19的S-蛋白进攻正常细胞，进而抑制COVID-19病毒的生长，消灭COVID-19，达到预防和治疗的效果。

另外，根据本发明上述实施例提出的一种表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，对所述hACE2基因基因进行PCR扩增的引物对为：

hACE2-F：5′-TATGTCAA GCTCTTCCTGGCCTAGA-3′；

hACE2-R：5′-CGGAAACAGGGGGCTGGTTTCGAG-3′。

根据本发明的实施例，所述哺乳细胞为Lenti-X293T细胞系。