[发明专利]稀有鮈鲫载脂蛋白ApoA1重组蛋白和抗兔多克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种稀有鮈鲫ApoA1基因，其特征在于，所述基因命名为GrApoA1，其核苷酸序列如SED ID NO：1所示。

2.一种稀有鮈鲫ApoA1基因，其特征在于，所述基因经过密码子优化，其核苷酸序列如SED ID NO：2所示。

3.一种稀有鮈鲫ApoA1蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SED ID NO：3所示。

4.一种稀有鮈鲫ApoA1重组表达蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

将密码子优化后的SED ID NO：2序列直接合成并连入pET30a表达载体，转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，挑选单克隆进行摇菌，IPTG诱导表达，收集菌体进行SDS-PAGE蛋白检测，超声破碎裂解细菌，纯化重组蛋白。

5.根据权利要求4所述的稀有鮈鲫ApoA1重组表达蛋白的制备方法，其特征在于，转化步骤为：向感受态细胞E.coli BL21中加入pET30a-GrApoA1重组质粒，轻轻混匀，在冰浴中静置5min，后置于42℃水浴热激90s，迅速转移至冰浴中。向每个离心管中加入900μL的无菌LB培养基，混匀后置于37℃摇床振荡培养45min，使菌体复苏，然后吸取100μL复苏的菌液涂布在含有卡纳青霉素抗性的LB固体培养基上，37℃培养12-16h。

6.根据权利要求5所述的稀有鮈鲫ApoA1重组表达蛋白的制备方法，其特征在于，诱导表达步骤为：挑选含有重组质粒的大肠杆菌，加入液体培养基，37℃震荡培养直至菌液OD600＝0.4～0.6，加入适量IPTG至终浓度1mM，诱导表达4h后，收集菌体，并用灭菌水重悬菌体，放入-80℃冻存，并反复冻融1-2次；取冻融后的重悬菌体在冰浴条件下进行超声波破碎，离心收集破碎后的上清液，并进行SDS-PAGE电泳检测。

7.根据权利要求5所述的稀有鮈鲫ApoA1重组表达蛋白的制备方法，其特征在于，纯化步骤包括：将超声破碎后的上清样品负载上Ni²⁺离子亲和层析柱，流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液；用15倍柱体积的Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白；使用5mL ElutionBuffer洗脱，收集洗脱蛋白。

8.一种稀有鮈鲫ApoA1蛋白抗兔多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求4～6任一项制备方法制备而成的稀有鮈鲫ApoA1重组表达蛋白作为抗原注入兔子体内，四次免疫后，采集兔血，分离血清，纯化后得到稀有鮈鲫ApoA1蛋白抗兔多克隆抗体。

9.一种稀有鮈鲫ApoA1蛋白抗兔多克隆抗体的制备方法，其特征在于，将稀有鮈鲫ApoA1重组表达蛋白浓度调整为1mg/mL作为抗原注射；佐剂和抗原为1:1体积比抽取；首免采用完全佐剂，二-四免采用不完全佐剂。

10.一种稀有鮈鲫ApoA1蛋白抗兔多克隆抗体的制备方法，其特征在于，GrApoA1-His多克隆抗体的检测方法为：

提取稀有鮈鲫的血清总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，在湿转法的条件下对血清总蛋白进行PVDF转膜，然后将PVDF膜放在5％的脱脂奶粉中封闭2h，并将纯化后的抗体按照1：1500进行稀释，并孵育2h，用TBST洗膜三次，每次5min，后用羊抗兔HRP标记的IgG二抗与PVDF膜孵育2h，再用TBST洗膜三次，最后用增强型的DAB显色试剂盒进行显色，并进行观察。