[发明专利]稀有鮈鲫载脂蛋白ApoA1重组蛋白和抗兔多克隆抗体的制备方法

说明书

本发明属于分子生物学基因工程领域，涉及稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)载脂蛋白ApoA1基因的核苷酸序列和所编码的氨基酸序列、以及密码子优化后的核苷酸序列，尤其涉及GrApoA1蛋白的重组表达制备方法和抗兔多克隆抗体的制备。通过重组表达GrApoA1蛋白可以进一步在体外分析该蛋白的结构和功能，另外多克隆抗体的制备能够为进一步检测鱼体内ApoA1的含量奠定基础。

技术领域

本发明属于分子生物学基因工程领域，具体涉及稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)载脂蛋白ApoA1基因的核苷酸序列和所编码的氨基酸序列、以及密码子优化后的核苷酸序列，尤其涉及GrApoA1蛋白的重组表达制备方法和抗兔多克隆抗体的制备。通过重组表达GrApoA1蛋白可以进一步在体外分析该蛋白的结构和功能，另外多克隆抗体的制备能够为进一步检测鱼体内ApoA1的含量奠定基础。

背景技术

ApoAl是高密度脂蛋白(HDL)的主要蛋白质组分，在脊椎动物广泛表达，约占HDL中蛋白总量的70％，其主要合成场所位于肝脏和小肠，具有抗炎、抗氧化及抗血栓、内皮保护的作用。ApoA1可通过高密度脂蛋白受体介导巨噬细胞中游离胆固醇的外流，启动胆固醇逆转运过程，在肝外组织清除过多胆固醇并选择性地促进脂质摄取发挥关键作用。在人类与动脉粥样硬化和其他心血管疾病紧密相关。稀有鮈鲫，属鲤科，鮈鲫属，较广泛地分布于我国四川省的成都平原及其西部边缘地区，是我国特有的小型鱼类。稀有鮈鲫具有体型小、繁殖周期短、对化学物质敏感等优良特点，被推荐为我国实验模式鱼。鱼类是理想的心血管疾病研究模型，对ApoA1的研究，有助于了解机体内胆固醇的转运过程。但是目前关于ApoA1的抗体主要集中于哺乳动物上，没有针对鱼类上可供应用的抗体。通过原核表达方法获得的重组蛋白，大多是以包涵体形式存在的，不具有生物学活性，而本技术方法，能够获得以可溶性方式存在的ApoA1重组蛋白，该蛋白直接具有生物学活性，不需要再通过复性等方法使其获得活性，生产工艺更加简便。而获得的抗兔ApoA1多克隆抗体，为以后在鱼类研究载脂蛋白的功能，提供了抗体支持。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了稀有鮈鲫载脂蛋白ApoA1的重组表达和多克隆抗体的制备方法，以解决缺少鱼类ApoA1检测抗体，无法进行ApoA1测定等问题。

本发明的技术方案如下：

一种稀有鮈鲫载脂蛋白ApoA1基因，所述ApoA1基因命名为GrApoA1，其核苷酸序列如SED ID NO：1所示。

一种密码子优化后的稀有鮈鲫载脂蛋白ApoA1基因，其核苷酸序列如SED ID NO：2所示。

一种稀有鮈鲫载脂蛋白ApoA1蛋白，其氨基酸序列如SED ID NO：3所示。

一种稀有鮈鲫载脂蛋白ApoA1的制备方法，包括以下步骤：

将密码子优化后的序列SEQ ID No.2进行合成，并直接连入pET30a载体，转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑选单克隆进行摇菌，IPTG诱导表达，收集菌体进行SDS-PAGE蛋白检测，超声破碎裂解细菌，纯化重组蛋白。

进一步的，转化步骤为：向感受态细胞E.coli BL21中加入pET30a-GrApoA1重组质粒，轻轻混匀，在冰浴中静置5min，后置于42℃水浴热激90s，迅速转移至冰浴中。向每个离心管中加入900μL的无菌LB培养基，混匀后置于37℃摇床振荡培养45min，使菌体复苏，然后吸取100μL复苏的菌液涂布在含有卡纳青霉素抗性的LB固体培养基上，37℃培养12-16h。

进一步的，诱导表达步骤为：挑选含有重组质粒的大肠杆菌，加入液体培养基，37℃震荡培养直至菌液OD600＝0.4～0.6，加入适量IPTG至终浓度1mM，诱导表达4h后，收集菌体，并用灭菌水重悬菌体，放入-80℃冻存，并反复冻融1-2次；取冻融后的重悬菌体在冰浴条件下进行超声波破碎，离心收集破碎后的上清液，并进行SDS-PAGE电泳检测。