[发明专利]一种手性羟基酸酯的生物制备方法

权利要求书

1.一种手性羟基酸酯的生物制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将脂肪酸经酮化酶球形烯单氧酶氧化后生成4-氧代脂肪酸；

（2）4-氧代脂肪酸经短链脱氢酶PpYSDR-M85Q/L136A不对称还原得到R-羟基酸酯；

所述短链脱氢酶PpYSDR-M85Q/L136A由野生型短链脱氢酶PpYSDR经突变改造制得；

野生型短链脱氢酶PpYSDR经突变改造制得短链脱氢酶PpYSDR-M85Q/L136A的步骤如下：

S1、突变体的构建：以含有突变点的寡核苷酸片段为引物分别进行PCR扩增反应，扩增含有PpYSDR基因的pET-30a重组质粒得到单点突变体后，再以该突变体的重组质粒为模板，另一突变体为引物，构建两点组合突变体；

S2、短链脱氢酶突变体的诱导表达：将步骤S1中构建的工程菌接种至50μg/mL卡那霉素的 LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜，再以1%接种量（v/v）接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6左右，加入终浓度为0.1mM IPTG，26℃诱导培养6h后，4℃、8000rpm离心10min收集菌体，-80℃储存备用；

所述的短链脱氢酶PpYSDR-M85Q/L136A的基因序列如SEQ ID NO.7所示；

所述的短链脱氢酶PpYSDR-M85Q/L136A的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

2.根据权利要求1所述的手性羟基酸酯的生物制备方法，其特征在于，所述步骤S1中构建突变体所使用的基因工程菌为大肠杆菌。

3.根据权利要求1所述的手性羟基酸酯的生物制备方法，其特征在于，所述步骤S1中构建突变体所使用的基因工程菌为E.coli BL21(DE3)大肠杆菌。

4.根据权利要求1所述的手性羟基酸酯的生物制备方法，其特征在于，所述步骤S1中构建突变体所使用的基因工程菌菌体的质量用量以菌体湿重计为50-300g/L。