[发明专利]基于冬瓜转录组序列开发的EST-SSR引物及其应用

权利要求书

1.基于冬瓜转录组序列开发的EST-SSR引物，其特征在于，所述引物包含3对引物，具体如下：

EST-2：上游引物序列：5'-GAGGGCTGCACCTCTTCATA-3'，下游引物序列：5'-CCAATTTGATACCTGCCAAAA-3'；

EST-1 6：上游引物序列：5'-ATTGGAGTTCGATCCGAATG-3'，下游引物序列：5'-CCCATTTCTCAATTCTTCTTCAA-3'；

EST-62：上游引物序列：5'-TGCGACAAATGTGGAGAGAG-3'，下游引物序列：5'-TTTTTGGAGTGGGTAAACCG-3'。

2.如权利要求1所述的基于冬瓜转录组序列开发的EST-SSR引物在构建冬瓜品种鉴别示意图中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，构建方法包括如下步骤：

（1）获得冬瓜样本的基因数据库；

（2）利用MISA软件对步骤（1）所述数据库进行SSR位点搜索；

（3）利用Primer 3.0设计SET-SSR引物，每条SSR产生3组引物，生成候选引物；

（4）随机选取6份冬瓜资源，利用CTAB法提取冬瓜基因组DNA，分别采用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳和分光光度计对DNA的品质和浓度进行检测，使用步骤（3）中的候选引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳初步筛选出含有目标条带的引物；

（5）提取40份冬瓜资源基因组DNA为模板，使用步骤（4）中初筛的PCR引物进行PCR扩增，扩增后利用核酸蛋白分析仪进行检测，筛选出能扩增出步骤（3）中的目标序列的引物，即得到用于冬瓜EST-SSR标记的引物；

（6）根据步骤（5）核酸蛋白分析仪检测结果，统计每对引物扩增的特征性谱带和多态性谱带大小；

（7）根据步骤（6）统计结果构建冬瓜品种鉴别示意图，具体方法如下：首先统计某一引物扩增的40份冬瓜品种指纹图谱电泳图中，在相同分子量片段处特征性谱带的有无，在相同的电泳迁移率处特征性谱带的有无，该处具有相同扩增谱带的品种资源分为一组，无此谱带的归为一组，之后继续加入引物依据相同的统计方法以此逐步再进行分类，直至所有参试材料品种均清晰地区分开，最后，按照鉴定结果绘制冬瓜品种鉴别示意图，将所有用到的引物和多态性谱带大小标记到冬瓜品种鉴别示意图对应位置；

步骤（4）中冬瓜资源样本为长至三叶一心时，2片健康嫩叶的混样；

步骤（4）DNA浓度稀释至50 ng·μL^-1，-20℃保存备用；

步骤（3）设计引物设置主要参数为：引物的长度为18-27 bp，GC含量45-55%，退火温度55-63℃，上下游Tm值相差不超过5℃，避免发卡结构、二聚体、错配、引物二聚体出现；

在步骤（4）中，所述PCR反应总体系25 μL，其中0.5 μL dNTP，0.3 μL Taq酶，1.5 μLDNA，上下游引物各1 μL，2.5 μL 10×Buffer含Mg²⁺，18.2 μL ddH₂O；

在步骤（4）中，所述PCR扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃复性30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃延伸10 min。