[发明专利]基于冬瓜转录组序列开发的EST-SSR引物及其应用

说明书

本发明公开了提供一种基于冬瓜转录组序列开发的EST‑SSR引物及其应用。该方法通过筛选冬瓜转录组序列的SSR位点，根据SSR位点两侧的核苷酸序列设计引物得到EST‑SSR引物。利用本发明所述的3对EST‑SSR引物对冬瓜资源进行扩增，全自动核酸蛋白分析仪验证的标记结果，能够应用于人工绘制冬瓜品种鉴别示意图的构建。根据SSR扩增结果可以快速、准确地将冬瓜资源区分开来，有效地鉴定了各个资源，可用于我国冬瓜属植物品种的种质鉴定、种质资源管理、品种权鉴定及保护等方面。

技术领域

本发明属于EST-SSR标记技术领域，具体涉及基于冬瓜转录组序列开发的EST-SSR引物及其应用。

背景技术

冬瓜属于葫芦科（Cucurbitaceae）冬瓜属（Benincasa Savi），是一年生蔓性草本植物。冬瓜是我国传统种植的蔬菜品种，已有2000多年的栽培历史。冬瓜育种方式主要依靠是常规杂交育种，由于但育种中新组合在杂交组合配制过程中随机性高的随机性高、品种间遗传基础狭窄，从而出现杂种优势不明显等问题，大大影响育种效率。我国冬瓜资源较为丰富，常出现各地域间相互引种栽培、育种，并各自命名的现象。在这过程中，容易出现发生同物异名或同名异物的问题，使得冬瓜的品种鉴定和产业化应用存在困难。因此，利用DNA分子标记系统地鉴定和评价冬瓜种质资源具有重要意义的。

核苷酸重复序列（Simple sequence repeat, SSR）是一类由几个碱基组成的基因序列串联重复而成的DNA序列。根据来源不同，SSR分为基因组SSR和植物表达序列标签-SSR（EST-SSR）EST-SSR。EST-SSR标记是以PCR技术为关键，直接从获得的EST序列中筛选SSR。因此，EST-SSR除了具有基因组SSR具有的共显性遗传、分布趋势随机、多态性强等优点外，与基因组SSR相比，基于EST序列开发的SSR标记，其通用性和保守性比基因组SSR高。近年来，虽有ISSR、SRAP、gSSR等标记运用于冬瓜研究中，但它们多采用通用引物，而有关冬瓜特异性引物数量较少，影响冬瓜育种进展。因此，冬瓜特异性引物成为冬瓜资源鉴定的重要部分。

根据EST-SSR特异性引物和PCR扩增后的特征性谱带，能够绘制冬瓜品种鉴别示意图。EST-SSR在人工绘制品种鉴别示意图法上的应用可以直观地的显示出鉴别过程，绘制不同品种间的图谱关系，准确地了解到区分品种所用的引物和多态性谱带大小（bp）。目前，基于冬瓜转录组序列开发的SSR引物在冬瓜人工绘制品种鉴别示意图构建中的应用尚未见报道。

发明内容

本发明公开了一种基于冬瓜转录组序列开发的EST-SSR引物及其应用，可以筛选出用于冬瓜EST-SSR标记的引物，有效提高冬瓜种质资源鉴定过程。

本发明是采用如下技术方案实现的：

基于冬瓜转录组序列开发的EST-SSR引物，包含3对EST-SSR引物，其序列如下所示：

EST-2：上游引物序列：5'- GAGGGCTGCACCTCTTCATA-3'；下游引物序列：5'-CCAATTTGATACCTGCCAAAA-3'；

EST-16：上游引物序列：5'- ATTGGAGTTCGATCCGAATG-3'；下游引物序列：5'-CCCATTTCTCAATTCTTCTTCAA-3'；

EST-62：上游引物序列：5'- TGCGACAAATGTGGAGAGAG -3'；下游引物序列：5'-TTTTTGGAGTGGGTAAACCG -3'。

本发明发现了基于冬瓜转录组序列开发的SSR引物在构建冬瓜品种鉴别示意图中的应用。

本发明提供了基于冬瓜转录组序列开发的SSR引物及其在人工绘制品种鉴别示意图构建的方法，包括如下步骤：

（1）获得冬瓜样本的基因数据库；