[发明专利]一种微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备方法

说明书

本发明公开了一种微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备方法，包括以下步骤：（1）醛基化阳离子脂质体的制备；（2）装载eGFP‑IL‑4质粒的脂质体的制备；（3）定向静电纺丝纤维膜的制备；（4）微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备。该微纳米纤维能够降低炎症反应、下调胶质纤维酸性蛋白分泌，减少瘢痕组织形成，促进血管生成，并持续释放NGF促进内源性干细胞神经分化能力及功能恢复。因此，该微纳米纤维是一种优先对脊髓损伤局部微环境免疫调控，而后为内源性干细胞提供神经分化平台为治疗目的的创新性响应性序贯式免疫调控和促神经再生的功能性生物支架，其为组织工程治疗脊髓损伤提供一种新策略。

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备方法。

背景技术

脊髓损伤导致损伤平面以下感觉和运动功能永久性改变甚至丧失，目前仍是人类医学进程中无法攻克的难题。原发性脊髓损伤后局部组织缺血坏死、炎症浸润、自由基氧化应激反应造成H⁺浓度升高形成酸性环境进一步破坏周围组织，同时炎症因子侵入引起继发性脊髓损伤逐步加重损伤程度。继发性脊髓损伤累及病变范围远超过原发性脊髓损伤，其中中枢神经系统激活的小胶质细胞和外周来源巨噬细胞是该免疫炎症反应主要参与者，研究表明脊髓损伤后活化的小胶质细胞和巨噬细胞在脊髓损伤后3天局部达到峰值，并且可极化为“经典活化”M1型和“替代活化”M2型两个细胞亚群，由于M1型巨噬细胞分泌炎症因子，因此被称为促炎细胞，M2型巨噬细胞分泌抑制炎症因子，被描述为抑炎细胞，所以小胶质细胞和巨噬细胞的精准调控在脊髓损伤修复过程中十分重要。因此，如何能在原发性脊髓损伤前期进行免疫调控避免或减轻继发性脊髓损伤，并持续为干细胞提供神经分化平台成为目前的挑战。

组织工程提出生物材料、种子细胞、生物因子三大要素，其中生物材料不仅为种子细胞粘附、增殖、分化提供理想平台，而且作为生长信息媒介成为核心部分。具有仿生结构的定向静电纺丝纤维被多次应用于神经组织修复研究中，但是静电纺丝仍然存在负载药物突释，药物流失过快、浓度过低等难题。前期，我们课题组开发的微溶胶静电纺丝技术与乳液电纺和同轴电纺相比具有显著优势：设备简单、过程稳定、载药率达80％、释放可达6周以上，为水溶性药物和蛋白类分子缓释开辟了一条新途径。此外，阳离子脂质体具备类细胞膜结构，可直接通过脂质交换、吸附、内吞等作用进入细胞内部为非病毒基因载体提供一新平台，而且非病毒基因转染载体介导的瞬时转染具有明显降低毒性和免疫反应，携带基因不整合到宿主基因组等优势。更重要的是有研究表明将静电纺丝技术与阳离子脂质体结合在组织再生和修复过程中更有成效。

除了生物材料，生物因子作为组织工程中引导和协调组织内部活动的重要成员。白细胞介素-4(IL-4)是趋化因子家族的一员，由白细胞分泌并在白细胞之间发挥调节作用的细胞因子，可与巨噬细胞表面受体结合使STAT6磷酸化，通过PI3K/AKT信号通路诱导Th2型免疫反应，能够促进组织修复和减轻炎症免疫应答。更有文献报道，IL-4可为中枢神经系统保护作用和促进内源性干细胞迁移至损伤部位为神经修复创造更有利微环境，并且IL-4在神经系统中可间接促进施旺细胞迁移、合成和释放神经生长因子。神经生长因子(NGF)具有营养神经元和促进轴突生长双重生物学作用，并在促进内源性干细胞向神经分化中扮演重要角色。在脊髓损伤所致病理条件下，局部神经生长因子消耗殆尽导致保护神经元和促进神经再生特性受损，因此在修复脊髓损伤时持续供应神经生长因子势在必行。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备方法，该微纳米纤维的制备受脊髓损伤病理酸性微环境启发，采用酸敏感性席夫碱键成功将负载NGF的氨基化定向微溶胶静电纺丝纤维束与负载IL-4质粒的醛基化阳离子脂质体组装，构建出响应脊髓损伤微环境序贯免疫调控和促神经再生的功能性微纳米纤维支架。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种微环境响应性免疫调控促神经再生微纳米纤维的制备方法，包括以下步骤：

(1)醛基化阳离子脂质体的制备