[发明专利]一种表达ASFV P30蛋白的PRV gE/gI双基因缺失株的构建方法

权利要求书

1.一种表达ASFV P30蛋白的PRV gE/gI双基因缺失株的构建方法，其特征在于：具体包括以下步骤，

S1：试剂准备：

LB液体培养基；限制性快切酶(Xho I、Sal I)；Lipefectamine TM 3000转染试剂；去内毒素质粒小量抽提试剂盒；DH5α大肠杆菌感受态细胞；

S2：克隆质粒的制备：

S2.1：在P30蛋白基因(CP204L)5’端引入Xho I酶切位点，3’端引入Sal I酶切位点，酶切位点后加AA碱基，合成CP204L基因片段，将CP204L基因片段克隆至载体pMD19-T的多克隆位点上，得重组质粒，即为亲本pMD19-CP204L；

S2.2：将上述亲本质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑取白色转化菌落，提取质粒后质粒酶切电泳及质粒测序验证插入正确的片段。

S3：构建PRV真核转移质粒pEGFP-CP204L：

S3.1：pEGFP-gI28k质粒DNA抽提；

S3.2：pMD19-CP204L和pEGFP-gI28k质粒的酶切回收；

S3.3：基因和质粒pEGFP-gI28K的连接；

S3.4：感受态细胞的转化；

S3.5：PRV真核转移质粒pEGFP-CP204L去内毒素质粒提取。

S4：PRV和pEGFP-CP204L质粒DNA的共转染：

先将pEGFP-CP204L质粒DNA根据Lipefectamine TM 3000转染试剂盒说明书转染入293T细胞，在转染10h后加入PRV XJ株病毒液，同源重组构建gE基因和gI基因缺失，共表达CP204L基因的重组伪狂犬病毒株rXJ gE/gI-CP204L。

2.根据权利要求1所述的一种表达ASFV P30蛋白的PRV gE/gI双基因缺失株的构建方法，其特征在于：所述步骤S1中，LB液体培养基是将酵母粉5g，胰蛋白胨10g和NaCl 10g溶解在1L蒸馏水中，调至pH＝7.2～7.6，待各组分溶解后高压灭菌得到。

3.根据权利要求1所述的一种表达ASFV P30蛋白的PRV gE/gI双基因缺失株的构建方法，其特征在于：所述步骤S3.1实现的具体步骤为：将pEGFP-gI28k菌种接入含50μg/mlkana的LB液体培养基中，37℃，300rpm过夜培养，用试剂盒抽提质粒DNA。

4.根据权利要求1所述的一种表达ASFV P30蛋白的PRV gE/gI双基因缺失株的构建方法，其特征在于：所述步骤S3.2实现的具体步骤为：将pEGFP-gI28k质粒DNA与S2.2操作步骤中已抽提的克隆pMD19-CP204L质粒进行双酶切，回收CP204L目的基因序列和pEGFP-gI28k线性质粒。

5.根据权利要求1所述的一种表达ASFV P30蛋白的PRV gE/gI双基因缺失株的构建方法，其特征在于：所述步骤S3.3实现的具体步骤为：根据回收片段和质粒浓度制定连接体系，恒温金属浴上16℃连接过夜10h。

6.根据权利要求1所述的一种表达ASFV P30蛋白的PRV gE/gI双基因缺失株的构建方法，其特征在于：所述步骤S3.4实现的具体步骤为：连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑取白色转化菌落，利用CP204L基因引物(5’-ATGAAAATGGAGGTCATC，3’-TTATTTTTTTTTAAAAGTTTAATGACC)PCR扩增筛选阳性克隆，提取质粒后质粒酶切电泳及质粒测序验证插入正确的片段。

7.根据权利要求1-6任一所述的一种表达ASFV P30蛋白的PRV gE/gI双基因缺失株的构建方法，其特征在于：所述的构建方法用于预防ASFV和PRV感染。