[发明专利]一种表达ASFV P30蛋白的PRV gE/gI双基因缺失株的构建方法

说明书

本发明公开了生物医药领域的一种表达ASFV P30蛋白的PRV gE/gI双基因缺失株的构建方法，具体包括以下步骤，S1：试剂准备；S2：克隆质粒的制备；S3：构建PRV真核转移质粒pEGFP‑CP204L；S4：PRV和pEGFP‑CP204L质粒DNA的共转染；合成P30蛋白基因(CP204L)片段，构建转移质粒pEGFP‑CP204L，利用经典的同源重组方式将ASFV CP204L基因插入PRV基因组替换gI和gE毒力基因，构建共表达P30蛋白的重组伪狂犬病毒株rXJ gE/gI‑CP204L可用于预防ASFV和PRV感染；克隆质粒制备简单，成本较低，适用于产业化生产。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体为一种表达ASFV P30蛋白的PRV gE/gI双基因缺失株的构建方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)引起的一种急性、热性、高度接触性、致死性动物传染病。非洲猪瘟除了能够感染所有品种和各年龄段的猪，其中表现为高热、全身出血、呼吸障碍和神经症状等症状。由于非洲猪瘟病毒毒力差异，非洲猪瘟的感染过程和临床症状有明显的差异，最急性和急性型感染致死率高达100％。至今世界范围内无有效疫苗，ASFV的扩散额蔓延将给养猪业带来毁灭性的打击。2018年8月3日，我国首次爆发非洲猪瘟疫情，截止2019年9月17日，全国已有31个省份发生非洲猪瘟疫情共154起，给中国养猪业带来巨大经济损失。p30蛋白在病毒感染的早期进行表达，具有比较好的抗原性，因此可以用该基因开发非洲猪瘟疫苗。

伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus)是猪奥耶斯基氏病(Aujeszky’s disease)的病原，该病毒属于疱疹病毒科(Herpesviridae)甲型疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)水痘病毒属(Varicellovirus)。PRV感染不同年龄段的猪只表现为不同的临床症状，新生仔猪主要表现为神经症状和脑膜脑炎，育肥猪表现为呼吸系统障碍，怀孕母猪表现为流产、产死胎、木乃伊胎和弱仔。

伪狂犬病毒基因组庞大，是很好的疫苗载体，通过对病毒复制中非必须基因的缺失，插入外源基因可以构建含有外源基因的重组疫苗。因此可利用本实验室保存PRV XJ株和pEGFP-gI28k真核表达质粒，构建表达ASFV P30蛋白的PRV gE/gI双基因缺失株，为研发非洲猪瘟病毒重组疫苗做铺垫。

基于此，本发明设计了一种表达ASFV P30蛋白的PRV gE/gI双基因缺失株的构建方法，以解决上述提到的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表达ASFV P30蛋白的PRV gE/gI双基因缺失株的构建方法，构建表达ASFV P30蛋白的PRV gE/gI双基因缺失株，填补现有的空白区域，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种表达ASFV P30蛋白的PRV gE/gI双基因缺失株的构建方法，具体包括以下步骤，

S1：试剂准备：

LB液体培养基；限制性快切酶(Xho I、Sal I)；Lipefectamine TM 3000转染试剂；去内毒素质粒小量抽提试剂盒；DH5α大肠杆菌感受态细胞；

S2：克隆质粒的制备：

S2.1：在P30蛋白基因(CP204L)5’端引入Xho I酶切位点，3’端引入Sal I酶切位点，酶切位点后加AA碱基，合成CP204L基因片段，将CP204L基因片段克隆至载体pMD19-T的多克隆位点上，得重组质粒，即为亲本pMD19-CP204L；

S2.2：将上述亲本质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑取白色转化菌落，提取质粒后质粒酶切电泳及质粒测序验证插入正确的片段。