[发明专利]一种基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体及其制备方法和应用，所述基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体中两个Val‑1(α)残基被羧甲基化，两个Lys‑99(α)残基被分子内交联。其中两个Lys‑99(α)残基进行分子内交联，形成的富马酰亚胺桥能改变成人血红蛋白(HbA)分子的静电相互作用，稳定HbA的紧张态(T态)，降低其氧亲和性；Val‑1(α)位于HbA中心空穴αα‑末端，能参与形成有助于稳定松弛态(R态)结构的盐桥，羧基化修饰会破坏这些盐桥，降低了HbA的R态稳定性，使得HbA的四级结构从R态向T态转移，降低HbA对氧的亲和力。本发明将两种修饰手段有机结合，提高HbA四聚体稳定性，增强静电相互作用，改善氧结合区域与氧的结合状态，具有很强的携/放氧活性。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种血红蛋白氧载体及其制备方法和应用，尤其涉及一种基于双重化学修饰的血红蛋白氧载体及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，随着我国临床用血需求的快速增长和无偿献血制度的实施，血液供需矛盾日趋突出。传统的输血方式在医疗救护中具有重要作用，同时也存在各种缺点，主要体现在：(1)由于窗口期的存在，输血存在病原体传播的风险，如血液中可能存在HIV、乙肝病毒等病原体；(2)我国血源短缺，临床血库储备不足，尤其是稀有血型患者可能因缺乏同型血而失去生命；(3)天然红细胞储存时间短，在4℃条件的血库中仅能保存5-6周，而且运输条件苛刻；(4)在输入人体前需进行交叉配血，不利于紧急情况下的抢救。这使得本就短缺的血源无法满足临床治疗及应急救援的需求，也限制了天然血液在大失血急救中的应用。

血红蛋白(Hemoglobin,Hb)是由四个亚基(ααββ)组成的四聚体蛋白，具有载氧功能。游离血红蛋白分子的四聚体因稳定性较差，解聚形成的二聚体易被肾小球过滤而引起肾毒性；因失去2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)的调节而无法有效地向组织供氧；因其容易被机体内的水解酶降解而缩短其在机体内的循环半衰期；因失去了氧化还原酶系统，容易自氧化生成无活性的高铁血红蛋白和氧自由基等问题。血红蛋白氧载体以人或动物源性血红蛋白为基础，通过化学改构去除其抗原性和毒性，延长其循环半衰期，从而能够安全、有效地替代红细胞发挥携/放氧活性。血红蛋白氧载体是一种理想的血液代用品，能够长期保存，无需交叉配型，可避免经血传播疾病，目前已成为国内外研究的热点之一。

血红蛋白氧载体主要通过血红蛋白的分子内交联、分子间聚合和高聚物修饰等方法制备。例如戊二醛聚合牛血红蛋白(HBOC-201)用于急性失血患者的治疗；右旋糖酐是血浆扩容剂的主要成分，其成本低廉，安全性高，扩充血容量的能力强，右旋糖酐化Hb具有扩充血容量与供氧的双重功能，适用于急性大失血患者的救治。

P₅₀指血红蛋白氧饱和度达到50％时的氧分压，是反映Hb与氧气结合难易程度的一种参数,采用小分子化学修饰的方法对血红蛋白进行定点修饰，可以提高血红蛋白的P₅₀，降低其氧亲和性，提高血红蛋白的携/放氧活性。

目前开发的血红蛋白氧载体普遍具有较高的氧亲和性，即较低的P₅₀值，不能向缺氧组织有效地释放结合的氧气。例如，PEG化Hb的P₅₀仅为4-6mmHg，远远低于血液的P₅₀(～28mmHg)，这是由于每个HbA分子平均结合了约6个分子量为5kDa的PEG。这些PEG分子所形成的水化层屏蔽了HbA的部分携/放氧活性位点。戊二醛聚合牛血红蛋白的P₅₀值也较低，一般小于10mmHg，由于牛血红蛋白的聚合是以低分子量的戊二醛为连接桥，多个牛血红蛋白分子之间比较靠近，进而产生了较大的空间屏蔽效应，使得部分携/放氧活性位点被屏蔽。此外，由于戊二醛介导的分子间交联减少了HbA的胶体颗粒数量，使得其胶体渗透压也低于血液，进而不能有效地扩充血容量。

发明内容