[发明专利]一种微生物核酸的提取纯化方法及试剂盒

权利要求书

1.一种微生物核酸的提取纯化方法，其特征在于，包括提取试剂的操作及纯化操作，提取试剂的操作包括如下步骤：

第一步，用移液器吸取1ml过夜培养的细菌加入1.5ml离心管中，离心4分钟；

第二步，倒尽上清，向1.5ml离心管内加入300μl LA缓冲液重悬细胞；

第三步，用移液器将1.5ml离心管内重悬的细胞混合液转移到2ml均质管内；

第四步，破碎均质管内的细胞；

第五步，均质或者漩涡震荡完毕后，向均质管内加入2μl蛋白酶K，涡旋混匀后57℃孵育20分钟；

第六步，向均质管内加入1000μl裂解缓冲液LB缓冲液，涡旋混匀后孵育5分钟；

第七步，将均质管内的混合液离心1分钟；

所述脱氧核糖核酸(DNA)和核酸(RNA)提取操作包括如下步骤：

DNA和RNA一起纯化：

——从第七步提取完毕后的均质管中吸取800μl上清液至新的2ml离心管中，加入800μl异丙醇涡旋混匀，

——吸取2ml离心管中的600μl混合液加入纯化柱内，离心30秒，倒去纯化柱收集管中的液体，再将纯化柱放回收集管中，重复此操作，直到1600ml混合液全部过柱完毕后；

——向纯化柱内加入600μl洗涤缓冲液WB1，离心30秒，倒去纯化柱收集管中的液体后，再将纯化柱放回收集管中；

——往纯化柱内加入600μl洗涤缓冲液WB2，离心30秒，再倒去纯化柱收集管中的液体，将纯化柱放回收集管中；

——纯化柱离心2分钟；

——用移液器往纯化柱中心加50μlTE缓冲液，盖上纯化柱的盖子，室温孵育5分钟；

——离心1分钟，洗脱纯化柱中的DNA和RNA，新的1.5ml离心管中即为纯化的细菌全基因组DNA和RNA；

核酸(RNA)提取：

——从第七步提取完毕后的均质管中吸取上清至纯化柱后离心过柱30秒，向纯化柱收集管内加入等量异丙醇，吸取收集管内的液体至纯化柱离心过柱30秒，用洗涤缓冲液WB1及WB2漂洗后，再向纯化柱收集管内加入DEPC水洗脱RNA,即得纯化RNA；

脱氧核糖核酸(DNA)提取：

——从第七步提取完毕后的均质管中吸取上清至纯化柱后离心过柱30秒，向纯化柱内加入等量600ul异丙醇，并用洗涤缓冲液WB1及WB2漂洗后，再向纯化柱收集管内加入TE缓冲液洗脱DNA,即得纯化DNA。

2.根据要求1所述的一种微生物核酸的提取纯化方法，其特征在于，所述LA缓冲液包括如下组分：

三羟甲基氨基甲烷盐酸盐,pH 8.0，10-50毫摩尔；乙二胺四乙酸1-10毫摩尔；曲拉通X-100 1％-5％；溶菌酶5-40毫克每毫升；超纯水。

3.根据要求1所述的一种微生物核酸的提取纯化方法，其特征在于，

所述裂解缓冲液LB包括如下组分：

氯化铵0.5-1摩尔；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10-50毫摩尔；硫氰酸胍0.4-2摩尔；氯化钠0.4-1摩尔；乙二胺四乙酸10-50毫摩尔；超纯水。

4.根据要求1所述的一种微生物核酸的提取纯化方法，其特征在于，

洗涤缓冲液WB1包括如下组分：

盐酸胍0.4-2摩尔；无水乙醇70％-80％。

5.根据要求1所述的一种微生物核酸的提取纯化方法，其特征在于，TE缓冲液包括如下组分：

PH8.0乙二胺四乙酸0.1毫摩尔；PH8.0三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐10毫摩尔；超纯水。

6.根据要求5所述的一种微生物核酸的提取纯化方法，其特征在于，

洗涤缓冲液WB2包括如下组分：

TE缓冲液20％-30％；无水乙醇70％-80％。

7.根据要求1所述的一种微生物核酸的提取纯化方法，其特征在于，

所述均质管内含有玻璃珠。

8.一种微生物核酸的提取纯化试剂盒，其特征在于，包括均质管、核酸纯化吸附柱、LA缓冲液、LB缓冲液、蛋白酶K、洗涤缓冲液WB1、洗涤缓冲液WB2及TE缓冲液。