[发明专利]一种微生物核酸的提取纯化方法及试剂盒

说明书

本发明涉及核酸提取和纯化技术领域，尤其涉及微生物核酸的提取纯化方法及试剂盒，微生物核酸的提取纯化方法包括提取所需关键试剂的配置及提取纯化操作，试剂盒包括均质管、核酸纯化吸附柱、LA缓冲液、LB缓冲液、蛋白酶K、洗涤缓冲液WB1、洗涤缓冲液WB2及TE缓冲液。本发明提供的方法不需要使用酚氯仿等危化品，且只需要使用一种通用的分离柱及裂解液就可以实现不同核酸物质的提取和核酸产物的纯化。

技术领域

本发明涉及核酸提取和纯化技术领域，尤其涉及一种微生物核酸的提取纯化方法及试剂盒。

背景技术

基因组DNA和RNA提取方法分为两个部分。

第一部分是细胞裂解。裂解细胞的目的是通过破坏细胞膜和(或)细胞壁来使得细胞破裂，从而释放出细胞中的核酸、蛋白和代谢物质。可以通过酶、物理和化学的方法来破坏细胞膜和(或)细胞壁。最常用的酶有溶菌酶、溶葡球菌酶、变溶菌酶和蛋白酶K，它们有各自不同的溶解对象，可以联合使用，亦可单独使用。物理的方法主要包括玻璃珠，磁珠，超声和温度。化学的方法主要是靠强酸、强碱或者有机(混合)物质。另外在实际的核酸提取过程中，也会参入细胞间质或者环境物资，它们会对于细胞裂解的效率产生影响。

第二部分是纯化核酸。纯化核酸的目的是要得到纯化的DNA和RNA分子，去除蛋白和代谢产物等其它细胞组分。核酸纯化的方法主要有两种，一种是通过化学物质来沉淀核酸物质，另一种是通过硅胶膜或者修饰过的磁珠黏附沉淀的核酸物质。化学物质沉淀方法，比较常用的有酚氯仿、高盐溶液和异丙醇。硅胶膜黏附沉淀的原理是核酸可以吸附在硅胶膜上，通过改变PH值来控制吸附力的强弱。磁珠黏附沉淀是通过高盐浓度下强烈的核酸吸附能力来实现核酸的分离。以上两种核酸纯化方法都需要注意化学物质和蛋白质的污染。

目前针对微生物的的核酸提取方案中，酚氯仿的技术主要问题是相关的成分是危化品，这给实验的操作带来危险，也给生物垃圾的处理提出更高的要求，不环保。目前大部分的实验室和产业公司都避免使用这种高危化学物质，因为实验室或者公司需要付出额外的管理和组织成本。并且大部分只能提取DNA或者只能提取RNA，有少数的微生物提取试剂盒可以同时提取DNA和RNA，例如，Zymo Research公司的Quick-DNA/RNA PathogenMiniprep产品。这个试剂盒可以做到同时提取微生物的DNA和RNA，这有利于下游的应用，比如，二代测序和荧光杂交。这个试剂盒的原理是通过化学物质和蛋白酶K(或者均质)来破解细胞膜(壁)，然后通过硅胶膜黏附来纯化脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。这个方法是目前在同时提取微生物的DNA和RNA方面最好的产品之一，它的操作方法也简便易行，可以同时提取不同的微生物的核酸。但是其只能同时获得DNA和RNA。该试剂盒不能分别提取RNA和DNA。

Bacterial DNA/RNA/Pro Kit也是使用硅胶膜黏附技术，该试剂盒可以分别抽提RNA或DNA，但是不提供同时抽提RNA和DNA的功能。ZymoBIOMICS^TM DNA/RNAMiniprep Kit可以提取DNA、RNA，但是该试剂盒需要用到3个不同的分离柱子，并且用到多种不同的裂解缓冲液。所以目前基于硅胶膜黏附技术的核酸抽提方法大多数情况都需要针对不同的应用，选择不同的试剂或者分离柱。这给用户的实际使用带来了更大的工作量和更多的支出。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供不需要使用酚氯仿等危化品，且且只需要使用一种通用的分离柱及裂解液就可以实现不同核酸物质的提取和核酸产物的纯化的一种微生物核酸的提取、纯化方法及试剂盒。本发明是通过以下技术方案予以实现：

一种微生物核酸的提取纯化方法，其包括提取操作及纯化操作，所述提取操作包括如下步骤：

第一步，用移液器吸取1ml过夜培养的细菌加入1.5ml离心管中，离心4分钟；

第二步，倒尽上清，向1.5ml离心管内加入300μl LA缓冲液重悬细胞；