[发明专利]靶向高危型HPV高频整合位点处人基因组序列的sgRNA和HaCaT细胞模型的制备

权利要求书

1.一种靶向高危型HPV高频整合位点处人基因组序列的sgRNA，其特征在于：所述高危型HPV分别为16型人乳头瘤病毒，且HPV高频整合位点为13q22位点时，13q22-sgRNA序列为：TACAGCCACTCACAGCCCGC，如SEQ ID No.1所示；

或者，所述高危型HPV为18型人乳头瘤病毒，且HPV高频整合位点为8q24位点时，8q24-sgRNA序列为：ACAAATAACTGTAAAGAGTA，如SEQ ID No.2所示。

2.一种权利要求1所述sgRNA对应的DNA序列，其特征在于：所述8q24-sgRNA序列对应DNA为：

8q24-sgRNA-DNA F：ACAAATAACTGTAAAGAGTA

R：TACTCTTTACAGTTATTTGT；

或者，所述13q22-sgRNA序列对应DNA为：

13q22-sgRNA-DNA F：TACAGCCACTCACAGCCCGC

R：GCGGGCTGTGAGTGGCTGTA。

3.一种高危型HPV基因定点整合的HaCaT细胞模型的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)针对高危型HPV在人类基因组中高频整合位点并结合碱基配对规律特异性设计sgRNA序列并得到sgRNA序列双链DNA；

2)在上述sgRNA双链DNA序列的正义链左端连接CAACCG，同时在反义链两端连接AAACNNNC，其中，NNN代表sgRNA的反义链序列；将sgRNA双链DNA制备成双链引物，分别将双链引物与pSpCas9(BB)-2A-GFP表达载体通过Bpil限制性核酸酶进行酶切连接，构建得到sgRNA表达质粒；

3)将上述sgRNA表达质粒分别转染靶细胞，通过T7E1实验筛选有效的sgRNA打靶质粒；

4)运用上述有效的sgRNA打靶质粒与含有高危型人乳头状瘤病毒HPV基因的线性Donor片段共转染HaCaT细胞，即得到高危型HPV基因定点整合的HaCaT细胞模型。

4.根据权利要求3所述高危型HPV基因定点整合的HaCaT细胞模型的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，高危型HPV分别为16型人乳头瘤病毒或18型人乳头瘤病毒。

5.根据权利要求4所述高危型HPV基因定点整合的HaCaT细胞模型的制备方法，其特征在于：所述高危型HPV为HPV16且HPV基因整合位点为13q22位点时，sgRNA序列为：TACAGCCACTCACAGCCCGC；

或者，高危型HPV为HPV18且HPV基因整合位点为8q24位点时，sgRNA序列为ACAAATAACTGTAAAGAGTA。

6.根据权利要求5所述高危型HPV基因定点整合的HaCaT细胞模型的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，HPV基因整合位点为8q24位点时，双链引物为：

8q24-sgRNA-primer F：CACCGACAAATAACTGTAAAGAGTA

R：AAACTACTCTTTACAGTTATTTGTC

或者，HPV基因整合位点为13q22位点时，sgRNA双链DNA为：

13q22-sgRNA3-primer F：CACCGTACAGCCACTCACAGCCCGC

R：AAACGCGGGCTGTGAGTGGCTGTAC。

7.根据权利要求5所述高危型HPV基因定点整合的HaCaT细胞模型的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中，HPV基因整合位点为13q22位点时，sgRNA打靶质粒由CRISPR-Cas9载体和靶向13q22位点的sgRNA的双链DNA组成；

或者，HPV基因整合位点为8q24位点时，sgRNA打靶质粒由CRISPR-Cas9载体和靶向8q24位点的sgRNA的双链DNA组成。