[发明专利]靶向高危型HPV高频整合位点处人基因组序列的sgRNA和HaCaT细胞模型的制备

说明书

本发明涉及一种靶向高危型HPV高频整合位点处人基因组序列的sgRNA和HaCaT细胞模型的制备。本发明针对HPV16在13q22和HPV18在8q24区域的整合位点分别设计特异性的sgRNA，并得到sgRNA双链DNA，将sgRNA双链引物分别与CRISPR/Cas9载体连接获得sgRNA表达载体，筛选得到sgRNA打靶质粒；运用克隆构建及PCR扩增分别合成含有高危型人乳头状瘤病毒HPV基因的线性Donor片段，与sgRNA打靶质粒共转染HaCaT细胞，获得HPV基因定点整合的HaCaT细胞模型。本发明运用CRISPR/Cas技术建立的HPV16及HPV18在人基因组高频位点整合的细胞模型，促进了HaCaT细胞的生长增殖，为高危型HPV整合在宫颈癌发病中的机制研究提供新的方法。

技术领域

本发明涉及医学生物技术领域，具体涉及一种靶向高危型HPV高频整合位点处人基因组序列的sgRNA和HaCaT细胞模型的制备。

背景技术

宫颈癌是世界女性第三大恶性肿瘤，其发病率高居妇科恶性肿瘤的首位。人乳头状瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染已被证实为宫颈癌的致病因素，绝大多数宫颈癌是由高危型HPV持续性感染引起的，HPV16和HPV18是最重要的两种高危型HPV。在HPV感染的早期，病毒基因组作为染色体以外的游离DNA随着宿主基因组的复制而复制。随着癌前病变的进展，病毒的癌基因逐渐发生与宿主基因组的整合，大多数病变在进展至宫颈癌的阶段都出现了病毒基因的整合，整合的出现与癌前病变到癌的进展过程密切相关，并被作为疾病进展的一个标志。

现有的关于HPV的研究大多关注于E6和E7癌基因的作用，忽略了HPV整合的重要作用。据TCGA数据显示，在HPV16阳性的宫颈癌中，76％的肿瘤发现了HPV病毒基因的整合，HPV18阳性的宫颈癌组织中，100％的肿瘤都存在HPV病毒基因的整合。研究显示，体外转染HPV虽然可以促使正常上皮细胞永生化，但是细胞的恶变仍需其他基因异常事件的参与，比如Ras基因的突变或DCC基因的缺失，对HPV转染所致的永生化细胞进行遗传学检测，发现细胞基因组产生了大量不稳定事件，比如双倍体、多倍体、染色体缺失和易位等。HPV基因转染后细胞出现的染色体非整倍体以及突变，提示我们宫颈癌的发生除了E6/E7的作用以外，还有细胞不稳定性事件的重要参与。

HPV整合是诱导基因组不稳定性的重要原因。大量的研究数据证实：HPV在人类基因组的整合并不是随机发生的，而是存在多个高频整合位点。这些位点多数分布在基因组脆性位点、癌基因或者抑癌基因附近，整合不仅破坏关键基因的结构和功能，还会引起整合位点附近基因组的大量扩增、缺失、重排和易位等，导致基因组强烈不稳定。有研究显示，HeLa细胞中整合在MYC附近的HPV基因发生了将近30个拷贝数的扩增，其中就包括HPV基因的URR区，其富含上皮特异性增强子元件，它的不断扩增诱导基因组强烈不稳定，引起整合位点处基因组DNA多次断裂与修复，导致MYC基因的大量扩增，促使细胞癌变。可见，HPV整合至宿主基因组是宫颈重大疾病发生发展的关键事件。

然而，E6和E7基因只是HPV感染以至整合宿主细胞的表达产物之一，仅凭这些现象还不足以证明E6/E7基因表达与细胞癌变之间的必然关系，癌细胞基因分子异常事件均是细胞经过长期克隆进化后的终产物，我们无法得知HPV整合诱导基因组不稳定性进而促进细胞恶变的生物学过程。由于HPV病毒本身的特点，我们无法在体外培养出完整有生物活性的HPV病毒，HPV基因转染的细胞模型，也不能揭示HPV真正的致病机制。因此，我们需要建立新的细胞模型，还原HPV整合致病的生物学过程，为HPV整合致癌的研究提供新的方法和理论依据。