[发明专利]非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物、检测方法及检测试剂盒

说明书

本发明公开一种非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物、检测方法及检测试剂盒。本发明的检测组合物是利用锁核酸的特点设计，对DNA有强大的识别能力和亲和力，能够有效提高非洲猪瘟病毒野毒株的检测效率，降低漏检的概率。本发明为非洲猪瘟病毒野毒株鉴定检测提供了一种新的检测方法和检测试剂，与现有的检测方法相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，比常规TaqMan探针荧光定量PCR方法的灵敏度高10倍；可用于区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360‑505R基因缺失的疫苗株，特别适用于科研及临床应用，具有很好的商业应用价值。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物、检测方法及检测试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASF virus，ASFV)引起的家猪和野猪的一种急性、烈性和高度接触性传染病，家猪急性感染死亡率可达100％。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告的动物疫病，中国将其列为一类动物疫病。

专利“基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的应用”(公开号：CN110093324A)已公布了非洲猪瘟Pig/CN/HLJ/2018中国流行株MGF360-505R基因缺失或CD2V与MGF360-505R基因联合缺失均能提供100％免疫保护，社会应用价值极大。但该疫苗使用后，现有常规检测方法将无法区分野毒感染阳性和疫苗接种阳性。基于MGF360-505R基因的检测方法可作为非洲猪瘟病毒野毒株的检测方法，用于区分非洲猪瘟野毒株与疫苗株。

目前ASF实验室检测方法主要包括病毒分离、ELISA、PCR等。病毒分离和ELISA操作繁琐，实验条件严苛，很难在条件一般的实验室开展。荧光定量PCR已在ASFV检测中广泛应用，但其存在因非特异性扩增而产生假阳性结果的缺点。因此，现有常规TaqMan探针荧光定量PCR检测方法仍有待进一步改进，应用改良的探针设计策略已成为核酸检测方法的新方向。

锁核酸(LNA)探针，是在TaqMan探针基础上选择性地将探针中的一些碱基修饰成LNA碱基，极大提高了探针与目标序列的亲和力，稳定性、特异性和灵敏度更高。应用锁核酸探针荧光定量PCR检测MGF360-505R基因，将为非洲猪瘟病毒野毒株的检测提供更加特异和灵敏的检测方法。

发明内容

本发明的首要目的在于弥补现有技术的缺点与不足，提供一种非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物。

本发明的另一目的在于提供包含上述检测组合物的非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测试剂盒。

本发明的再一目的在于提供基于上述检测试剂盒的非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测方法。

本发明的目的通过下列技术方案实现：一种非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物，包括用于扩增非洲猪瘟病毒野毒株的1组特异性引物对和1条在引物对的扩增靶标区域内的LNA-Taqman探针。

所述的特异性引物对的序列如Seq ID No.1和Seq ID No.2所示。

所述的LNA-Taqman探针的序列如Seq ID No.3所示。

所述的LNA-Taqman探针的序列中，第11位的碱基“T”、第12位的碱基“C”和第13位的碱基“C”均为锁核酸。

所述的LNA-Taqman探针在5′端标记荧光物质，3′端标记淬灭物质。

所述的5′端标记荧光物质为标记FAM。

所述的3′端标记淬灭物质为标记BHQ1。

上述非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量PCR检测组合物在制备非洲猪瘟病毒野毒株检测试剂盒中的应用。