[发明专利]一种类I型胶原蛋白纤维的制备方法

说明书

本发明公开了一种类I型胶原蛋白纤维的制备方法，属于基因工程技术领域。本发明以N和C端(GPP)_n序列为基础，在中间插入连续的Gly‑Xaa‑Yaa三联体的胶原蛋白序列，形成三段式的嵌合胶原蛋白P‑CL‑P模式。通过N和C端的(GPP)n三股螺旋间的相互作用驱动自组装，形成具有周期性明暗相间条纹的带状纤维。本发明的方法可制备得到清洁来源的能自组装形成具有周期性明暗相间条纹的纤维，其结构与I型胶原蛋白类似，制备工艺简单，能够大规模生产成本低的胶原蛋白纤维，在生物材料领域有着广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种类I型胶原蛋白纤维的制备方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

胶原蛋白是一种生物性的高分子，是由三条链相互缠绕形成的三股螺旋结构。胶原蛋白根据其基因序列和功能作用可分为28种类型，其中最为主要是的I型胶原蛋白。在高等生物细胞中，I型胶原的原蛋白经过翻译后修饰、折叠、切割等一系列成熟化过程后，多个胶原蛋白三股螺旋(简称胶原蛋白)交错排列，形成间距均匀的明暗条纹状的胶原蛋白纤维(图1),其形貌对于细胞的粘附与生长有关键性的作用^[1]，也是促进人体组织和器官的修复和再生的生物材料。

I型胶原蛋白主要用于治疗皮肤烧伤的创面敷贴、外科和牙科手术的止血海绵、骨缺损填充物等生物医用材料中，也广泛应用于化妆品与食品工业中，市场需求量庞大。目前市场上的I型胶原蛋白产品主要是来源于动物皮肤与跟腱等结缔组织，其主要优点是生物兼容性高、易被人体吸收，但是易被动物源带有的疾病如朊蛋白等污染。为了提高胶原材料的生物安全性，如何制备清洁来源的I型胶原蛋白是生物医学材料领域中备受关注的问题。

目前主要有以下三种制备方法：(1)化学合成胶原样多肽，(2)原核与真核微生物宿主异源表达重组胶原蛋白，(3)高等生物宿主异源表达，如转基因植物培育、动物细胞培养。化学合成的胶原样多肽虽然具有纯度高、易于修饰功能基团等优点，但是制备成本过高，不利于大规模生产。转基因植物和哺乳动物细胞表达体系的普遍问题是培养条件严苛、表达量低、生产周期长。微生物表达体系具有成本低和表达量高等明显优势。目前研究表明，越来越多的哺乳动物和细菌胶原被证实能够在细菌和酵母等宿主中高效的异源表达，并且正确折叠成胶原蛋白三股螺旋。重组胶原在生物材料生产中具有潜在的应用，但是缺乏形成高级结构的自组装驱动力，不能形成胶原蛋白纤维，限制了其在生物材料和组织工程方面的应用。Barbara Brodsky等人通过表达全长和两倍长度的酿脓链球菌胶原蛋白Scl2，切除球状引导折叠域后的胶原区域能够自组装形成纤维，通过加长序列长度能够促进自组装的能力，但是这些重组胶原序列无法形成与天然胶原类似的、具有规整明暗条带的纳米纤维形貌^[2]。

参考文献：

1.Friedrichs,J.,A.Taubenberger,C.M.Franz,and D.J.Muller,CellularRemodelling of Individual Collagen Fibrils Visualized by Time-lapseAFM.Journal of Molecular Biology,2007.372(3):p.594-607.

2.Nelson,D.L.,A.L.Lehninger,and M.M.Cox,Lehninger principles ofbiochemistry.2008:Macmillan.

发明内容

本申请通过在不同来源的胶原蛋白的N端和C端融合表达(GPP)₁₀，促进胶原蛋白的高聚自组装，形成胶原蛋白纤维。

本发明的第一个目的是提供一种类I型胶原蛋白，由三条蛋白单链围绕一个共同的中心轴盘绕，构成三螺旋结构；所述蛋白单链的氨基酸排布方式为：其中，(GPP)_n的n满足5＜n≤30，CL-domain的氨基酸序列如SEQID NO.2～6任一序列所示。