[发明专利]一种间充质干细胞培养基用于化妆品的制备方法

权利要求书

1.一种间充质干细胞培养基用于化妆品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)1号培养基的制备：取420ml的高糖MEM倒入容器中，向其中分别加入5ml 100X青/链霉素混合液、5ml 100X丙酮酸钠、5ml 100X非必须氨基酸、5ml 100X谷氨酰钠和50ml胎牛血清，混匀后，过滤除菌，备用；

(2)氯化锂母液的制备：称取100mg氯化锂固体，溶于8ml高糖MEM中，充分溶解后定容至10ml，此溶液浓度为10mg/ml；

(3)2号培养基的制备：取416ml的高糖MEM倒入容器中，向其中分别加入5ml 100X青/链霉素混合液、5ml 100X丙酮酸钠、5ml 100X非必须氨基酸、5ml 100X谷氨酰钠和50ml胎牛血清，同时添加氯化锂母液4ml，混匀后，过滤除菌，备用；

(4)间充质干细胞(MSC)的分离与培养：将脐带组织沿脐带纵向切开，剥离其中的血管；用剪刀分离脐带组织内侧的沃顿胶，将分离的沃顿胶切成1mm³的小块，然后将其接种于细胞培养皿中，加入适量的1号培养液，将培养皿放置于温度为37℃、二氧化碳浓度为5％的培养箱中培养10-14天，期间于第二天适当加液后，每隔三天换1号培养液一次；细胞培养至80％融合度，用0.5％胰酶-EDTA溶液消化已经贴壁的间充质干细胞，并按照1：3的比例进行传代培养，传代后的细胞取其中一部分进行间充质干细胞条件培养基的制备，其余细胞以2x10⁶/ml的密度进行冻存；

(5)间充质干细胞条件培养基(MSC-CM)的制备：取第四次传代的细胞，将细胞以1x10⁵/ml的密度分别接种于1号培养基和2号培养基中，待细胞在两种培养基中生长至90％融合度，小心弃去培养上清，加入适量1X HBSS溶液(对于10cm细胞培养皿，可加入10ml-15mlHBSS溶液)清洗细胞两次，彻底吸干残留的HBSS溶液，加入无血清的高糖DMEM培养基，于温度为37℃、二氧化碳浓度为5％的培养箱中继续培养72h后，将2种细胞培养上清分别收集于50ml离心管中，1000g离心10分钟，去除细胞碎片，测量上清体积，向每个上清中加入适量20％无菌蔗糖溶液，使蔗糖的终浓度达到1％(W/V)，将上述液体分装成10ml/瓶(青霉素瓶)，转入真空冷冻干燥瓶中，-80℃预冷冻后，在真空冷冻干燥机中冻干后保存于-80℃冰箱中备用。两种条件培养基分别标记为MSC-CM 1：在1号培养基中培养的MSC所制备的条件培养基；MSC-CM2：2号培养基(含氯化锂的培养基)中培养的MSC所制备的条件培养基。

2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞培养基用于化妆品的制备方法，其特征在于：所述(1)中青/链霉素混合液的终浓度为100ug/ml。

3.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞培养基用于化妆品的制备方法，其特征在于：所述(5)中的高糖DMEM含青霉素(100u/ml)/链霉素(100ug/ml)，并添加以下相应成分：丙酮酸钠(1mM)、非必须氨基酸(10uM)、L-谷氨酰胺(2mM)、巯基乙醇(55uM)、上表皮生长因素(10ng/ml)和氯化锂母液(80ug/ml)。

4.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞培养基用于化妆品的制备方法，其特征在于：所述1号培养基和2号培养基的容积为500ml。

5.一种间充质干细胞条件培养基，其通过权利要求1-4中任一项所述的方法制备。