[发明专利]一种间充质干细胞培养基用于化妆品的制备方法

说明书

本发明公开了一种间充质干细胞培养基用于化妆品的制备方法，包括以下步骤：(1)1号培养基的制备；(2)氯化锂母液的制备；(3)2号培养基的制备；(4)间充质干细胞的分离与培养；(5)间充质干细胞条件培养基的制备：取第四次传代的细胞，将细胞以1x10⁵/ml的密度分别接种于1号培养基和2号培养基中，弃去培养上清，加入适量1X HBSS溶液清洗细胞两次，彻底吸干残留的HBSS溶液，加入无血清的高糖DMEM培养基，去除细胞碎片，向每个上清中加入适量20％无菌蔗糖溶液，将上述液体分装成10ml/瓶，转入真空冷冻干燥瓶中，在真空冷冻干燥机中冻干后保存于‑80℃冰箱中备用。本发明与现有技术相比的优点在于：使用效果好、利用率高、成本低。

技术领域

本发明涉及间充质干细胞技术领域，具体是指一种间充质干细胞培养基用于化妆品的制备方法。

背景技术

间充质干细胞(MSC)是一类各种组织中普遍存在的、与相应的组织损伤的修复有着密切关系的一类异质性细胞，是修复组织器官的主要原料来源之一；MSCs在体内生长过程中，会通过分泌一些细胞因子抑制炎症的发展，并调节形成新生血管，促进血管形成、促进创伤组织的细胞生长，参与创面的损伤修复，最终促进创面上皮化和肉芽组织形成，实现加速创面愈合的进程；体外培养的MSC所分泌的这些具有组织损伤修复功能的生物活性分子，会释放到培养上清中，这种培养上清收集后被称为MSC条件培养基。

MSC的条件培养基(Mesenchymal Stem Cell Conditional Medium，MSC-CM)是指间充质干细胞(MSC) 在体外培养一段时间以后收集的细胞培养上清，其中含有MSC在生长过程中所分泌的具有生物活性的蛋白质分子，如具有调节细胞生长和血管组织生成的细胞因子，核酸分子，如具有细胞生长调节功能的小 RNA(MicroRNA)等生物活性分子。众多的文献报道MSC-CM的成分相对比较复杂，其生物学功能主要为调节细胞生长和分化由于MSC-CM在皮肤损伤的修复与皮肤的抗衰老方面具有较强的功能，MSC-CM 有望应用于皮肤损伤的修复(如烧伤、糖尿病足等)和皮肤抗衰老为目的的化妆品中，吸引了众多的研究者开发新的方法与技术，提高MSC-CM的产量，增强其生物学功能，降低产品制备的成本。

研究表明锂离子是一种双向调节的化合物，实验动物的研究表明适量的锂元素有助于骨质的形成，同时适量的锂元素对于神经细胞也具有保护作用，培养基中低浓度的锂离子可以促进MSC的增殖，而高浓度的锂离子则会抑制MSC的增殖与分化。普遍认为，锂离子有助于骨质形成与神经保护作用是由于锂离子促进了MSC的增殖和分化，而对于是否锂离子的使用使MSC所分泌的活性因子有所增加，改善了细胞生长的微环境，目前未见报道。在我们的研究中发现在培养基中添加低浓度的氯化锂将有助于提高 MSC-CM中活性物质的产量。

现有技术中的间充质干细胞培养基用于化妆品的制备方法在使用时，不仅使用效果不好，间充质干细胞条件培养基中含有活细胞，在使用细胞时具有免疫排斥、潜在的致瘤性、不易保存与运输等缺点，而且间充质干细胞的利用率低，提高了间充质干细胞条件培养基的制备成本。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服以上技术缺陷，提供一种使用效果好、利用率高、成本低的一种间充质干细胞培养基用于化妆品的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种间充质干细胞培养基用于化妆品的制备方法，包括以下步骤：

(1)1号培养基的制备：取420ml的高糖MEM倒入容器中，向其中分别加入5ml 100X青/链霉素混合液、5ml 100X丙酮酸钠、5ml 100X非必须氨基酸、5ml 100X谷氨酰钠和50ml胎牛血清，混匀后，过滤除菌，备用；

(2)氯化锂母液的制备：称取100mg氯化锂固体，溶于8ml高糖MEM中，充分溶解后定容至10ml，此溶液浓度为10mg/ml；