[发明专利]核苷类亲水作用色谱固定相及制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种核苷类亲水作用色谱固定相及制备方法及应用，核苷类化合物包括腺苷、胞苷、鸟苷和尿苷，固定相为先将硅烷偶联剂键合到硅胶载体上制备硅烷化硅胶，而后利用硅烷偶联剂中的环氧烷和氨基的开环反应，将核苷键合到硅胶载体上，进而获得式一所示的核苷类亲水作用色谱固定相。本发明的固定相原料易得，合成步骤简单，固定相以高比例的乙腈流动相进行分离，避免了使用正相色谱需要用到的强毒性和高危性有机试剂，适用于核苷碱基类物质的分离分析，采用环氧烷与氨基开环反应作为键合方式，可以在温和的条件下实现高选择性和高转化率的固载。

技术领域

本发明涉及色谱固定相，具体地说是核苷类亲水作用色谱固定相及制备方法及应用。

背景技术

近年来，随着蛋白质组学、生物医学和环境监测等研究领域的快速发展，强极性和亲水性小分子物质迅速成为分析化学和生物化学领域的重要研究对象，准确、高效的分离这些物质就变得极其重要。这些物质通常很难在反相液相色谱柱上得到有效分离，正相液相色谱往往使用一些昂贵且危险的流动相，如正己烷或环己烷来分离这些极性物质。然而，在这种非水溶性的流动相中，许多极性和亲水性化合物往往难以溶解，限制了正相色谱的应用。因此，亲水作用色谱(Hydrophilic InteractionChromatography,HILIC)被视为分离强极性和亲水性化合物的一种替代方案。与流动相为非极性有机相的正相色谱不同，HILIC的流动相往往由水或缓冲液和60-95％的乙腈或甲醇组成，其类似于反相色谱的流动相。强极性分析物在此类流动相中有较大的溶解度，因此，HILIC已成为一种非常适合于极性和亲水性物质分离及分析的液相色谱技术。目前，已有众多亲水作用色谱固定相被商业化。根据其键合基团的结构可分为：醇型、胺型、两性离子型、氰基型、多糖型和纯硅胶型等。由于实际样品的复杂性和分离要求的多样性，目前还没有一种亲水作用色谱能够满足大部分极性化合物分离的要求，因此开发新型亲水作用色谱固定相是一项十分重要的工作。

腺苷、胞苷、鸟苷和尿苷是一类遍布人体细胞的内源性核苷，由嘌呤的N-9或嘧啶的N-1与D-核糖的C-1通过β糖苷键连接而成的化合物。这类化合物分子中含有一分子的碱基和一分子的糖环，它们自身带有的羟基和氨基使其具有良好的亲水性。多年来，核苷碱基类的物质多作为分析物用于HILIC保留模式的研究，还未有将其制备成亲水作用色谱固定相的报道。根据核苷类化合物自身的性质，将它们制备成亲水作用色谱固定相并用于极性和亲水性物质的分离，是十分有意义的工作。

发明内容

本发明的目的是提供一种核苷类亲水作用色谱固定相及制备方法及应用，核苷类化合物包括腺苷、胞苷、鸟苷和尿苷。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

本发明公开了核苷类亲水作用色谱固定相，核苷类化合物包括腺苷、胞苷、鸟苷和尿苷，固定相为式一所示：

作为进一步地改进，本发明所述固定相为先将硅烷偶联剂键合到硅胶载体上制备硅烷化硅胶，而后利用硅烷偶联剂中的环氧烷和氨基的开环反应，将核苷键合到硅胶载体上，进而获得式一所示的核苷类亲水作用色谱固定相。

本发明还公开了一种制备核苷类亲水作用色谱固定相的制备方法：

1)将硅胶经硅烷化修饰制备硅烷化硅胶

将硅胶，有机溶剂，硅烷偶联剂按质量比为1：(7-30)：(2.3-3)混合，混合后于90-130℃条件下反应12-48h，反应结束后过滤、洗涤，洗涤后真空干燥既得硅烷化硅胶；其中，有机溶剂为无水甲苯，每克硅胶所需的质量为5～30g，约10～40mL；反应完成后用丙酮抽提12-24h，洗涤后45～100℃下真空干燥12～24h。在保证硅胶可以均匀分散在有机溶剂的情况下，适当增加硅烷偶联剂的加入量，可以提高硅烷偶联剂键合到硅胶表面的效率。

2)硅烷化硅胶与核苷类化合物的反应