[发明专利]一种细胞内超氧化物的检测方法

权利要求书

1.一种细胞内超氧化物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1)使用二甲亚砜将荧光探针溶解作为母液，使用细胞培养基配置成含有荧光探针的细胞培养液；

步骤2)细胞置于含胎牛血清的细胞培养基中培养，当细胞汇合率为70％～80％时，用胰酶消解，培养基重悬制成单细胞悬液，调节细胞浓度，接种到孔板，过夜培养；

步骤3)制备烟气冷凝物：抽取卷烟样品并抽吸，收集烟气总粒相物，根据烟气总粒相物的质量加入相应体积的二甲亚砜，得到烟气总粒相物储备液；

步骤4)：将步骤2)培养得到的细胞，经步骤3)制备的烟气冷凝物暴露处理，更换步骤1)制备得到的细胞培养液继续培养；

步骤5)使用荧光显微镜观察细胞内荧光探针的荧光信号，获取细胞内超氧化物的浓度水平。

2.根据权利要求1所述的细胞内超氧化物的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述细胞培养基为a-MEM培养基，其成分是不含核糖核酸和脱氧核糖核酸，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml，1000mg/LD-葡萄糖，292mg/LL-谷氨酰胺，110mg/L丙酮酸钠，2200mg/L碳酸氢钠，pH值7.0-7.4。

3.根据权利要求1所述的细胞内超氧化物的检测方法，其特征在于，所述荧光探针为BES-So-AM，其结构式如式(I)所示：

4.根据权利要求1所述的细胞内超氧化物的检测方法，其特征在于，所述荧光探针为BES-H₂O₂-Ac，其结构式如式(II)所示：

5.根据权利要求1所述的细胞内超氧化物的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中，细胞培养在37℃、5％CO₂条件下培养。

6.根据权利要求1所述的细胞内超氧化物的检测方法，其特征在于，所述步骤3)中，抽吸卷烟样品用RM20H转盘型吸烟机在ISO和HCI两种抽吸条件下分别进行。

7.根据权利要求6所述的细胞内超氧化物的检测方法，其特征在于，所述在抽吸卷烟样品前，在(22±1)℃和相对湿度(60±3)％条件下平衡36-48h。

8.根据权利要求1所述的细胞内超氧化物的检测方法，其特征在于，所述步骤5)中，使用荧光显微镜在485nm条件下观察。

9.根据权利要求1所述的细胞内超氧化物的检测方法，其特征在于，所述步骤5)中，使用荧光显微镜在505nm条件下观察。

10.根据权利要求1所述的细胞内超氧化物的检测方法，其特征在于，所述超氧化物包括O^2-、H₂O₂。