[发明专利]一种细胞内超氧化物的检测方法

说明书

本发明公开一种细胞内超氧化物的检测方法，使用二甲亚砜将荧光探针溶解作为母液，使用细胞培养基配置成含有荧光探针的细胞培养液；细胞置于含胎牛血清的细胞培养基中培养；抽取卷烟样品并抽吸，收集烟气总粒相物，根据烟气总粒相物的质量加入相应体积的二甲亚砜，得到烟气总粒相物储备液；细胞培养；使用荧光显微镜观察细胞内荧光探针的荧光信号，获取细胞内超氧化物的浓度水平。本发明通过研究烟气暴露后细胞内的活性氧浓度水平，用于评估烟气暴露对细胞的氧化应激反应的影响，对烟气成分的安全性进行生物学评价，反向为安全卷烟的研发和生产提供科学参考。

技术领域

本发明属于细胞内活性氧的生化分析技术领域，涉及一种细胞内超氧化物的检测方法。

背景技术

活性氧(Reactive oxygen species,ROS)是一类具有高化学活性的小分子基团，包括了羟基自由基、氮氧自由基、烷氧自由基和过氧化物等，细胞内过高的活性氧水平能够对细胞膜、功能蛋白以及核酸造成损伤，并可能进一步导致疾病的发生。卷烟烟气是一种重要的人居环境污染物，被证明含有大量活性氧，主要包括气相部分的烷氧自由基、氮氧自由基以及粒相部分的芳香烃自由基、醌基自由基等，这些活性氧分子进入生物体内能够影响细胞内的氧化应激反应，并最终对DNA产生不可逆的氧化损伤。

目前对活性氧的分析检测方法主要有化学发光法、紫外-可见吸收分光光度法、荧光光度法、电子自旋探针以及电化学分析等方法，其中荧光分析法由于具有高选择性、高灵敏度、以及能对活性氧物种进行实时跟踪等优点，已在生命科学、食品科学、环境科学等领域得到了广泛应用。性能优良的荧光探针是构筑相应荧光分析方法的基础。近年来，随着合成技术的不断提高，一系列具有发射波长长、光稳定性好、量子产率高的有机荧光分析被开发出来并用于细胞内活性氧物质的分析。

吸烟引起基因损伤、蛋白异常表达、外源性化合物代谢异常等多个生理反应，表观反映是多个生物效应的发生，如氧化应激、炎症反应、外源物质代谢异常等。发明人希望通过研究烟气暴露后细胞内的活性氧浓度水平，用于评估烟气暴露对细胞的氧化应激反应的影响，对烟气成分的安全性进行生物学评价，反向为安全卷烟的研发和生产提供科学参考。目前，还未有相关的研究。

发明内容

鉴于此，本发明目的在于提供一种能够准确测量烟气影响下的细胞内超氧化物的检测方法。

发明人通过长期的探索和尝试，以及多次的实验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种细胞内超氧化物的检测方法，包括如下步骤：

步骤1)使用二甲亚砜将荧光探针溶解作为母液，使用细胞培养基配置成含有荧光探针的细胞培养液；

步骤2)细胞置于含胎牛血清的细胞培养基中培养，当细胞汇合率为70％～80％时，用胰酶消解，培养基重悬制成单细胞悬液，调节细胞浓度，接种到孔板，过夜培养；

步骤3)制备烟气冷凝物：抽取卷烟样品并抽吸，收集烟气总粒相物，根据烟气总粒相物的质量加入相应体积的二甲亚砜，得到烟气总粒相物储备液；

步骤4)：将步骤2)培养得到的细胞，经步骤3)制备的烟气冷凝物暴露处理，更换步骤1)制备得到的细胞培养液继续培养；

步骤5)使用荧光显微镜观察细胞内荧光探针的荧光信号，获取细胞内超氧化物的浓度水平。

根据本发明细胞内超氧化物的检测方法的一个优选实施方式，所述步骤1)中，所述细胞培养基为a-MEM培养基，其成分是不含核糖核酸和脱氧核糖核酸，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml，1000mg/LD-葡萄糖，292mg/LL-谷氨酰胺，110mg/L丙酮酸钠，2200mg/L碳酸氢钠，pH值7.0-7.4。

根据本发明细胞内超氧化物的检测方法的一个优选实施方式，所述荧光探针为BES-So-AM，其结构式如式(I)所示：