[发明专利]一种流式细胞仪检测细胞内超氧化物的方法

权利要求书

1.一种流式细胞仪检测细胞内超氧化物的方法，其包括如下步骤：

步骤1)烟气冷凝物制备：按照GB/T 5606.1—2004抽取卷烟样品，并用吸烟机抽吸，收集烟气总粒相物，根据烟气总粒相物的质量加入相应体积的DMSO，得到烟气总粒相物储备液；

步骤2)免疫荧光标记：细胞铺板，过夜培养；更换含有超氧自由基检测荧光探针和过氧化氢检测荧光探针的细胞培养基继续培养，再添加步骤1)所述烟气冷凝物的细胞培养基继续培养；

步骤3)样品处理：将步骤2)培养获得的细胞使用PBS洗涤，加入70％乙醇溶液进行固定，低温过夜；使用PBS洗涤后，使用含有triton-100的PBS溶液透化，PBS清洗；加入胰酶消化，用培养基终止消化；分离出细胞并重新分散，待流式细胞仪测定；

步骤4)检测：使用流式细胞仪检测对荧光探针的染色强度进行检测，检测前进行三色荧光补偿，检测时用CD45-PerCP/SSC设门，用于将异常细胞群与正常细胞群分开，将异常细胞群圈出设门后，每份样品捕获分析上万个细胞。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述吸烟机抽吸用RM20H转盘型吸烟机在ISO和HCI两种抽吸条件下分别抽吸。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤1)中，用剑桥滤片收集烟气总粒相物。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤1)中，烟气总粒相物储备液浓度为10mg/mL。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤2)中，铺板细胞密度为2.5×10⁵cells/mL。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤2)中，分离细胞的具体方式为，终止消化后，加入1mLPBS溶液，吹打培养板底部，使细胞脱落，2500转/分钟离心，重复操作3-5次。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤4)中，使用流式细胞仪检测在488nm和530nm条件下对荧光探针的染色强度进行检测。

8.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤2)具体为：细胞密度为2.5×10⁵cells/mL进行铺板，过夜培养；更换含有浓度为50μM的超氧自由基检测荧光探针和过氧化氢检测荧光探针的细胞培养基继续培养一个小时，之后分别添加60μg/mL的烟气冷凝物的细胞培养基进行细胞培养1小时。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤3)具体为：将步骤2)培养的细胞使用PBS洗涤三次，每次三分钟；加入70％乙醇溶液进行固定，4℃过夜；使用PBS洗涤三次后，使用含有1％triton-X100的PBS溶液透化10min，再PBS清洗三次；加入胰酶消化，使用培养基终止消化；加入1mLPBS溶液，吹打培养板底部，使细胞脱落，2500转/分钟离心，重复操作3次，重新分散待流式细胞仪测定。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤4)中流式细胞仪的检测条件为488nm和530nm。