[发明专利]一种流式细胞仪检测细胞内超氧化物的方法

说明书

本发明公开一种流式细胞仪检测细胞内超氧化物的方法，其包括烟气冷凝物制备、免疫荧光标记、样品处理和检测步骤。本发明的检测方法中的操作步骤简单、便捷，检测周期短，仅需数小时即可完成检测，极大地缩短了检测周期，有利于加快相关研究的进度，节省了时间成本。本发明通过研究烟气暴露后细胞内的活性氧浓度水平，用于评估烟气暴露对细胞的氧化应激反应的影响，对烟气成分的安全性进行生物学评价，反向为安全卷烟的研发和生产提供科学参考。

技术领域

本发明属于细胞内活性氧的生化分析技术领域，涉及一种细胞内超氧化物的检测方法，尤其涉及一种利用流式细胞仪检测氧自由基、活性氧的方法。

背景技术

超氧化物是含有超氧离子(O^2-)的一类化合物，是氧气分子的单电子还原产物，广泛存在于自然界中。超氧离子是一个自由基，一个氧原子带有一个未成对电子，与氧气分子一样呈顺磁性。活性氧(Reactive oxygen species,ROS)是一类具有高化学活性的小分子基团，包括了羟基自由基、氮氧自由基、烷氧自由基和过氧化物等，细胞内过高的活性氧水平能够对细胞膜、功能蛋白以及核酸造成损伤，并可能进一步导致疾病的发生。卷烟烟气是一种重要的人居环境污染物，被证明含有大量活性氧，主要包括气相部分的烷氧自由基、氮氧自由基以及粒相部分的芳香烃自由基、醌基自由基等，这些活性氧分子进入生物体内能够影响细胞内的氧化应激反应，并最终对DNA产生不可逆的氧化损伤。

目前对活性氧的分析检测方法主要有化学发光法、紫外-可见吸收分光光度法、荧光光度法、电子自旋探针以及电化学分析等方法，其中荧光分析法由于具有高选择性、高灵敏度、以及能对活性氧物种进行实时跟踪等优点，已在生命科学、食品科学、环境科学等领域得到了广泛应用。性能优良的荧光探针是构筑相应荧光分析方法的基础。近年来，随着合成技术的不断提高，一系列具有发射波长长、光稳定性好、量子产率高的有机荧光分析被开发出来并用于细胞内活性氧物质的分析。

吸烟引起基因损伤、蛋白异常表达、外源性化合物代谢异常等多个生理反应，表观反映是多个生物效应的发生，如氧化应激、炎症反应、外源物质代谢异常等。发明人希望通过研究烟气暴露后细胞内的活性氧浓度水平，用于评估烟气暴露对细胞的氧化应激反应的影响，对烟气成分的安全性进行生物学评价，反向为安全卷烟的研发和生产提供科学参考。目前，还未有相关的研究。

发明内容

鉴于此，本发明目的在于提供一种能够准确测量烟气影响下的细胞内超氧化物的检测方法。

发明人通过长期的探索和尝试，以及多次的实验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种流式细胞仪检测细胞内超氧化物的方法，其包括如下步骤：

步骤1)烟气冷凝物制备：按照GB/T 5606.1—2004抽取卷烟样品，并用吸烟机抽吸，收集烟气总粒相物，根据烟气总粒相物的质量加入相应体积的DMSO，得到烟气总粒相物储备液；

步骤2)免疫荧光标记：细胞铺板，过夜培养；更换含有超氧自由基检测荧光探针和过氧化氢检测荧光探针的细胞培养基继续培养，再添加步骤1)所述烟气冷凝物的细胞培养基继续培养；

步骤3)样品处理：将步骤2)培养获得的细胞使用PBS洗涤，加入70％乙醇溶液进行固定，低温过夜；使用PBS洗涤后，使用含有triton-100的PBS溶液透化，PBS清洗；加入胰酶消化，用培养基终止消化；分离出细胞并重新分散，待流式细胞仪测定；

步骤4)检测：使用流式细胞仪检测对荧光探针的染色强度进行检测，检测前进行三色荧光补偿，检测时用CD45-PerCP/SSC设门，用于将异常细胞群与正常细胞群分开，将异常细胞群圈出设门后，每份样品捕获分析上万个细胞。

根据本发明流式细胞仪检测人口腔表皮样细胞内氧自由基的方法的一个优选实施方式，所述吸烟机抽吸用RM20H转盘型吸烟机在ISO和HCI两种抽吸条件下分别抽吸。