[发明专利]一株联产1,3-丙二醇和聚羟基丁酸酯的基因工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一株联产1,3-丙二醇和聚羟基丁酸酯的基因工程菌，其分类命名为肺炎克雷伯氏菌Q3-PHB (Klebsiella pneumoniaeQ3-PHB)，其保藏登记号为CCTCC M 20191090。

2.权利要求1所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，以肺炎克雷伯氏菌ATCC 25955为出发菌株，敲除其醛/醇脱氢酶基因、乳酸脱氢酶基因和富马酸还原酶基因，并导入Cupriavidus necator来源的phbCBA基因后，得到所述基因工程菌。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）以肺炎克雷伯氏菌ATCC 25955为出发菌株，依次敲除醛/醇脱氢酶基因、乳酸脱氢酶基因和富马酸还原酶基因，得到同时缺失三个基因的重组肺炎克雷伯氏菌；

（2）将phbCBA基因插入pDK7中，构建重组质粒pDK7-phbCBA;

（3）将所述重组质粒pDK7-phbCBA导入缺失三个基因的重组肺炎克雷伯氏菌，得到所述联产1,3-丙二醇和聚羟基丁酸酯的基因工程菌。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于步骤（1）中所述缺失三个基因的重组肺炎克雷伯氏菌的构建方法如下：将肺炎克雷伯氏菌醛/醇脱氢酶基因上、下游同源臂，以自杀质粒pKR6K为载体与肺炎克雷伯氏菌ATCC 25955进行同源重组，敲除醛/醇脱氢酶基因；然后以自杀质粒pKR6K为载体依次将乳酸脱氢酶基因上、下游同源臂和富马酸还原酶基因上、下游同源臂与肺炎克雷伯氏菌同源重组，敲除乳酸脱氢酶基因和富马酸还原酶基因。

5.权利要求1所述的基因工程菌在联产1,3-丙二醇和聚羟基丁酸酯中的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于采用含有甘油的发酵培养基培养权利要求1所述的基因工程菌，制备1,3-丙二醇和聚羟基丁酸酯。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于发酵温度为35-39℃，通气量为2.5-3.5 L/min，搅拌转速为200-300rpm，发酵过程中维持pH为6.3-6.8，当OD₆₀₀达到0.6~0.8时，加入IPTG诱导；发酵过程中，当甘油浓度小于2g/L时，补加甘油使发酵液中甘油浓度维持在20~30g/L。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于发酵培养基含有如下组分：K₂HPO₄·3H₂O 5-7g/L，KH₂PO₄1.5-2.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25-0.4g/L，硫酸铵4-6g/L，酵母膏 0.8-1.2g/L，柠檬酸钠 0.5-0.7g/L，甘油15-25g/L，微量元素溶液 0.8-1.2ml/L；所述微量元素溶液含有CaCl₂·2H₂O 3.2 mg/L， ZnCl₂ 3.8 mg/L， FeCl₃·6H₂O 30.0 mg/L， MnCl₂·4H₂O11.14 mg/L， CuCl₂·2H₂O 0.96 mg/L， CoCl₂·6H₂O 2.64 mg/L， H₃BO₃ 0.35 mg/L，Na₂MoPO₄·2H₂O 24.5 μg/L，氯霉素 20ug/mL。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于将种子液接入发酵培养基中进行发酵培养，种子液培养基含有如下组分：K₂HPO₄·3H₂O 6-8g/L，KH₂PO₄1.5-2.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.05-0.15g/L，酵母膏 6.5-7.5g/L，硫酸铵1-1.5g/L，甘油18-22g/L，微量元素溶液 0.8-1.2ml/L；所述微量元素溶液含有CaCl₂·2H₂O 3.2 mg/L， ZnCl₂ 3.8 mg/L，FeCl₃·6H₂O 30.0 mg/L，MnCl₂·4H₂O 11.14 mg/L，CuCl₂·2H₂O 0.96 mg/L，CoCl₂·6H₂O 2.64 mg/L，H₃BO₃ 0.35mg/L，Na₂MoPO₄·2H₂O 24.5 μg/L，氯霉素 25 μg/mL。