[发明专利]一株联产1,3-丙二醇和聚羟基丁酸酯的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明提供一株联产1,3‑丙二醇和聚羟基丁酸酯的基因工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。该基因工程菌分类命名为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)Q3‑PHB，其保藏登记号为CCTCC M 20191090。本发明菌株构建方法简单，采用分批补料发酵方法，最终实现菌体的生物量大幅度增加，1,3丙二醇产量达到76.21 g/L，1,3‑丙二醇转化率为0.56mol/mol，乙醇和乳酸含量被有效控制在1g/L以下，同时菌体积累PHB达菌体干重的42.36%，不仅减少了生产成本，还大幅度降低了下游的分离成本，综合经济效益较高，具有工业应用价值。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一株联产1,3-丙二醇和聚羟基丁酸酯(PHB)的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的平台化学品，自上世纪90年代被开发出来后，广泛应用于医药、化妆品和高分子材料等行业。1,3-丙二醇主要用作单体与对苯二甲酸聚合生成新型聚酯材料聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)。PTT具有许多优越的特性，如伸展性、柔韧性、易加工性、耐热性和稳定性等。也正是基于这些性质，PTT在合成纤维和工程塑料领域具有极高的应用价值，进一步促进了其合成单体PDO的研究和开发。

在自然界中存在一些能够天然利用甘油合成1,3-丙二醇的微生物，如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)等。由于肺炎克雷伯氏菌所具有甘油代谢速率快、1,3-丙二醇产量高和能耐受高浓度1,3-丙二醇的特点，已被广泛应用于1,3-丙二醇的工业化生产。

然而，利用肺炎克雷伯氏菌发酵生产1,3-丙二醇的过程中，往往伴随着许多副产物的合成，如2,3-丁二醇、乙醇、乳酸、丁二酸、乙酸等。这些副产物的积累不仅会降低1,3-丙二醇对甘油的得率，还会导致菌体生长抑制，增加发酵过程中的原料成本和下游产物分离成本。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一株联产1,3-丙二醇和聚羟基丁酸酯的基因工程菌，该菌构建方法简单，生产过程中副产物积累少，菌体生物量高，能够实现胞外1,3-丙二醇和胞内聚羟基丁酸酯(PHB)的高效积累，大大降低了生产成本和产物分离成本，具有较高的工业应用价值。

本发明的另一目的在于提供所述联产1,3-丙二醇和聚羟基丁酸酯的基因工程菌的构建方法，该方法简单高效。

本发明的再一目的是提供所述基因工程菌株在制备1,3-丙二醇和聚羟基丁酸酯方面的应用。

为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案：

一株联产1,3-丙二醇和聚羟基丁酸酯的基因工程菌，其分类命名为肺炎克雷伯氏菌Q3-PHB(Klebsiella pneumoniaeQ3-PHB)，其保藏登记号为CCTCC M20191090。

本发明还提供所述基因工程菌的构建方法，以肺炎克雷伯氏菌ATCC 25955为出发菌株，敲除其醛/醇脱氢酶基因、乳酸脱氢酶基因和富马酸还原酶基因，并导入Cupriavidusnecator来源的phbCBA基因后，得到所述基因工程菌。

优选的技术方案中，所述构建方法包括如下步骤：

(1)以肺炎克雷伯氏菌ATCC 25955为出发菌株，依次敲除醛/醇脱氢酶基因、乳酸脱氢酶基因和富马酸还原酶基因，得到同时缺失三个基因的重组肺炎克雷伯氏菌；

(2)将phbCBA基因插入pDK7中，构建重组质粒pDK7-phbCBA；

(3)将所述重组质粒pDK7-phbCBA导入缺失三个基因的重组肺炎克雷伯氏菌，得到所述联产1,3-丙二醇和聚羟基丁酸酯的基因工程菌。