[发明专利]一种适合沙棘的DNA提取方法

权利要求书

1.一种适合沙棘的DNA提取方法，其特征在于它按以下步骤实现：

一、取沙棘幼嫩叶片两枚置于EP管中加入蒸馏水，预冷处理，取出后自然风干并剪碎，得到剪碎的叶片；

二、用液氮将研钵预冷，加PVP于研钵中，加剪碎的叶片，加液氮将叶片研磨至粉末状，然后转移至离心管中，每管0.2～0.4g，再加入预冷的去糖缓冲液和β-巯基乙醇，混合后冰上静止9-15min，离心3-4min，弃上清，收集沉淀；其中PVP和剪碎的叶片的质量比为：0.04～0.06：1；

三、在上述沉淀中加入1mL 65℃预热的CTAB提取缓冲液、0.1～0.2mL的2mg/mL蛋白酶K和70～90μl的硼砂，置于超声波清洗器中65℃水浴5～10min，然后常温下离心，取上清液并加入80μl的PVP，常温下离心，取上清液；

四、取步骤三最终得到的上清液至离心管中，加入等体积的混合溶液，然后于37℃水浴处理30-35min，并每隔5min颠倒混匀，常温下离心，取上清液于EP管中；混合溶液：4～6mmol/L盐酸胍、10～20mmol/LTris-HCl和质量浓度20％～30％的乙醇；

五、向步骤四得到的上清液中加入质量浓度20％～30％的乙醇，然后再加入Tris-酚、氯仿和异戊醇的混合液，颠倒混匀，离心，取上清液；

六、向步骤五上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液，震荡混匀后，离心，取上清液；

七、向步骤六上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后于-20℃沉淀30-35min，然后4℃下离心，取沉淀，再用2倍体积的质量浓度为70％的乙醇洗涤沉淀2～3次，离心，取沉淀并自然风干；

八、向风干后的沉淀中加入含RNase的TE溶液，37℃水浴处理30-35min，置于冰箱保存，即完成沙棘的DNA提取；

其中步骤二中所述去糖缓冲液：3mol/L KAc，1mol/L氯化钠，0.1mol/L Tris-HCl，0.02mol/L EDTA，PH8.0；

步骤三中所述CTAB提取缓冲液：1.5mol/lNaCl，0.1mol/L Tris-Hcl，0.02mol/L EDTA，2mol/lPVPK-90。

2.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法，其特征在于步骤一中取沙棘幼嫩叶片两枚，置于含5mL蒸馏水的10mLEP管中，并于4℃下预处理24h。

3.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法，其特征在于步骤二中加0.05gPVP于研钵中，加1g剪碎的叶片，加液氮将叶片研磨至粉末状，然后转移至2mL离心管中，每管0.3g，再加入1mL的-18℃预冷的去糖缓冲液和10μl的β-巯基乙醇，混合后冰上静止10min，4℃下5000rpm离心3min，弃上清，收集沉淀。

4.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法，其特征在于步骤三中0.15mL的2mg/mL蛋白酶K和80μl的硼砂。

5.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法，其特征在于步骤三中是在常温下12500rpm离心10min，取上清液并加入80μl的PVP，常温下10000rpm离心8min。

6.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法，其特征在于步骤四中混合溶液后于37℃水浴处理30min，并每隔5min颠倒混匀，常温下400rpm离心10min，取上清液于10mLEP管中；混合溶液：5mmol/L盐酸胍、15mmol/LTris-HCl和质量浓度为25％乙醇。

7.根据权利要求1所述的一种适合沙棘的DNA提取方法，其特征在于步骤五中向步骤四上清液中加入2mL的质量浓度为30％的乙醇，然后再加入5mL的Tris-酚、氯仿和异戊醇的混合液，颠倒混匀，4℃下12000rpm离心5min，取上清液；其中Tris-酚、氯仿和异戊醇的混合液中Tris-酚、氯仿和异戊醇的体积比为22:24:1。