[发明专利]一种适合沙棘的DNA提取方法

说明书

一种适合沙棘的DNA提取方法，本发明涉及一种适合沙棘的DNA提取方法。本发明的目的是解决现有提取沙棘DNA的方法存在DNA纯度低的问题，本发明通过研磨前预冷，去掉了部分糖类物质，在研磨加入了PVP，减少了酚类、单宁类物质的影响，络合多酚和萜类物质，防止多酚类褐变而氧化，去糖缓冲液去除了糖类物质，为后续提取高质量DNA打好基础；用在CTAB缓冲液中加入蛋白酶K，在加快细胞膜破裂的同时，蛋白酶协同步骤四的盐酸胍去除了沙棘DNA中的粗蛋白，提高了DNA的纯度和产量。制备出的DNA OD260/OD280值可达1.92，DNA的纯度较高。本发明应用于分子生物学领域。

技术领域

本发明属于生物技术领域。

背景技术

沙棘为胡颓子科沙棘属，是一种落叶性灌木，为药食同源植物，其根、茎、叶、花、果，特别是沙棘果实含有丰富的营养物质和生物活性物质，具有止咳化痰、健胃消食、活血散瘀等功效。现代医学研究，沙棘可降低胆固醇，缓解心绞痛发作，还有防治冠状动脉粥样硬化性心脏病的作用；沙棘成长周期较长，一般3～4年才开花结果，为实现其经济价值，沙棘在分子生物学方面的研究亟待展开，便于后续在其优质种株鉴定，病虫害防治等方向的研究。

进行分子生物学分析的关键第一步，是提取高质量的基因组DNA，这是获得准确试验结果的基础。沙棘组织中富含多糖、多酚和粗蛋白，这些次生代谢物会严重的阻扰DNA的提取纯化。现有CTAB法提取植物基因组织中的DNA，是在CTAB缓冲液中加入PVP以去除少许多糖，加上用Tris-酚:氯仿:异戊醇来抽提蛋白质，OD260/OD280比值低于1.8，说明仍有较多的多糖及蛋白质与DNA混杂在一起，DNA纯度低。因此需要更加有效的方法来解决提取DNA中存在多糖和粗蛋白污染的问题，获得高纯度DNA。

发明内容

本发明的目的是解决现有提取沙棘DNA的方法存在DNA纯度低的问题，而提供一种适合沙棘的DNA提取方法。

一种适合沙棘的DNA提取方法，它按以下步骤实现：

一、取沙棘幼嫩叶片两枚置于EP管中加入蒸馏水，预冷处理，取出后自然风干并剪碎，得到剪碎的叶片；

二、用液氮将研钵预冷，加PVP于研钵中，加剪碎的叶片，加液氮将叶片研磨至粉末状，然后转移至离心管中，每管0.2～0.4g，再加入预冷的去糖缓冲液和β-巯基乙醇，混合后冰上静止9-15min，离心3-4min，弃上清，收集沉淀；其中PVP和剪碎的叶片的质量比为：0.04～0.06：1；

三、在上述沉淀中加入1mL 65℃预热的CTAB提取缓冲液、0.1～0.2mL的2mg/mL蛋白酶K和70～90μl的硼砂，置于超声波清洗器中65℃水浴5～10min，然后常温下离心，取上清液并加入80μl的PVP，常温下离心，取上清液；

四、取步骤三最终得到的上清液至离心管中，加入等体积的混合溶液，然后于37℃水浴处理30-35min，并每隔5min颠倒混匀，常温下离心，取上清液于EP管中；混合溶液：4～6mmol/L盐酸胍、10～20mmol/L Tris-HCl和质量浓度20％～30％的乙醇，

五、向步骤四得到的上清液中加入质量浓度20％～30％的乙醇，然后再加入Tris-酚、氯仿和异戊醇的混合液，颠倒混匀，离心，取上清液；

六、向步骤五上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液，震荡混匀后，离心，取上清液；

七、向步骤六上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后于-20℃沉淀30-35min，然后4℃下离心，取沉淀，再用2倍体积的质量浓度为70％的乙醇洗涤沉淀2～3次，离心，取沉淀并自然风干；

八、向风干后的沉淀中加入含RNase的TE溶液，37℃水浴处理30-35min，置于冰箱保存，即完成沙棘的DNA提取；