[发明专利]一种不含免疫源性的脐带间充质干细胞冻存液及方法

说明书

本发明公开了一种不含免疫源性的脐带间充质干细胞冻存液及方法，包括脐带血自体血清、右旋糖苷‑40、二甲基亚砜、无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP，所述脐带血自体血清、右旋糖苷‑40、二甲基亚砜按照体积占比依次为：60％‑90％、2％‑15％、2％‑18％,无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP的质量与脐带血自体血清体积比为0.1，本发明使用了人工合成抗冻蛋白I作为辅助原料来帮助干细胞提高抗冻效果，提高冻存后干细胞活率；无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP是一种抑制冰晶生长的蛋白质，其机理是能以非依数性形式降低水溶液的冰点，从而导致水溶液的熔点和冰点之间出现差值，这种差值称为热滞活性或抗冻活性，差值越大，抗冻活性就越大。

技术领域

本发明涉及细胞冻存技术领域，具体是一种不含免疫源性的脐带间充质干细胞冻存液及方法。

背景技术

低温保存技术是一种广泛采用的长时间保存生物样本的方法。通常我们所述的低温保存技术是指低温条件下，照样能够维持生物样本活性暂停的技术。通常都是将活的生物体采用特殊的方法冷却至低温(-196℃)，并长期保存，待需要之时，可将生物体按照特殊的方法加热至正常问题，仍然可以获得活的生物体。干细胞(stem cell)是一种能够具有自我更新、复制、多潜能行细胞。脐带间充质干细胞是干细胞家族中的重要一员，也是目前阶段众多研究者的热点。它能在体外无限的扩增，被认为是细胞治疗最有潜力的细胞来源之一。

现有冻存保护剂发明与本发明最相近的方案，其冻存液其主要成分包括DMSO、右旋糖苷、无血清培养基构成，现有技术明显的两个缺点，一是绝大部分的干细胞冻存液都是采用胎牛血清FBS作为冻存保护剂的主要原料，该冻存保护剂的最大缺陷在于该细胞存在动物血清来源，无法避免病原菌的污染。本发明使用的是自体脐带血血清替代胎牛血清FBS作为其保护液的主要原料，减少病原菌的污染，更安全；二是不管是含胎牛血清FBS的冷冻保护剂还是无血清的冷冻保护剂，它们在干细胞降温冻存的过程中都无法避免干细胞活率降低，最主要的原因在于干细胞抗冻效果低，本发明冻存液中含无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP，其作用就是降低水溶液的冰点，提高干细胞的抗冻活性，从而提高干细胞活率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种不含免疫源性的脐带间充质干细胞冻存液及方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种不含免疫源性的脐带间充质干细胞冻存液，包括脐带血自体血清、右旋糖苷-40、二甲基亚砜、无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP。

作为本发明进一步的方案：所述脐带血自体血清、右旋糖苷-40、二甲基亚砜按照体积占比依次为：60％-90％、2％-15％、2％-18％；无免疫源性的人重组抗冻蛋白AFP的质量与脐带血自体血清体积比为0.1。

作为本发明进一步的方案：所述脐带血自体血清、右旋糖苷-40、二甲基亚砜按照体积占比依次为：70％-85％、3％-13％、4％-15％。

作为本发明进一步的方案：所述脐带血自体血清、右旋糖苷-40、二甲基亚砜按照体积占比依次为：80％、10％、10％。

一种干细胞冻存方法，包括以下步骤：

步骤一：按上述配方量配置得到冷冻液A；

步骤二：从培养基中分离出附着有干细胞的微载体，将微载体加入到冷冻液A中，得到细胞悬浮液B；

步骤三：将细胞悬浮液B放置于低温处理24小时，得到冻存细胞C；

步骤四：将冻存细胞C放入液氮中保存。

作为本发明再进一步的方案：步骤三中的低温处理至少为-80℃的低温。

作为本发明再进一步的方案：步骤三中的低温处理为持续降温，在前6小时内将温度从室温匀速降低至目标温度，然后维持该目标温度至24小时。