[发明专利]一种筛选产油丝状真菌的方法

说明书

本发明公开了一种筛选产油丝状真菌的方法，其中，一种适用于产油丝状真菌的氯化三苯基四氮唑PDA培养基，其包括，配置马铃薯琼脂培养基；加入三氯生和氯化三苯基四氮唑，使得马铃薯琼脂培养基含有5mg/L三氯生和0.5g/L氯化三苯基四氮唑；一种筛选产油丝状真菌的方法，其为：取土壤于无菌水中，震荡1～3h后稀释菌液；将所述菌液涂布在氯化三苯基四氮唑PDA培养基上，分离产油丝状真菌和/或产油丝状真菌孢子，纯化即得菌体。本发明通过优选得配置培养基、筛选产油丝状真菌，并对其进行脂质提取，获得了提高了油脂的获得效率。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种筛选产油丝状真菌的方法。

背景技术

产油丝状真菌是一类可以高产油脂的丝状真菌，可用来生产多种多不饱和脂肪酸。多不饱和脂肪酸具有多种重要的功能，如：缓解炎症、治疗糖尿病、预防心脑血管疾病、维持人类正常的认知功能等，对人类的营养与健康具有重要的意义。因此快速高效地筛选出生长性状优良的、具有自主知识产权的产油丝状真菌，并将其应用于商业化生产意义深远。

目前筛选产油丝状真菌的传统方法有低温筛选法、菌落微缩法、抗性筛选法等，但是传统方法传统筛选方法存在诸多弊端，无法做到快速、高效地定向筛选产油丝状真菌，不能大规模进入工业化生产。因此，建立一种高效的筛菌策略，快速筛选生长性状优良的高产多不饱和脂肪酸的丝状真菌具有重要意义。

脂肪酸合成酶(FAS)是生物体内源性脂肪酸合成过程的关键酶，它通过催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A而生成长链脂肪酸。FAS包括乙酰基转移酶(AT)、丙二酰基转移酶(MT)、B一酮脂酰合酶(KS)、B一酮脂酰还原酶(KR)、p-羟脂酰脱水酶(HD)、烯脂酰还原酶(ER)及硫酯酶(TE)等7个功能域。它可分为I型和Ⅱ型两种亚型，真菌和哺乳动物中的FAS属I型，细菌和植物中的FAS属Ⅱ型。

三氯生，学名“二氯苯氧氯酚”，常态为白色或灰白色晶状粉末，稍有酚臭味。不溶于水，易溶于无水乙醇等有机溶剂。三氯生是以FabI为靶点的抗生素类抑制剂，其抗菌机制在于特异性地抑制脂肪酸合成酶(FAS)的烯脂酰还原酶(ER)，因此三氯生不只是具有抑制脂肪酸合成酶活性较弱的菌种正常生长特性的抗生素类抑制剂，还是高效广谱抗菌剂，对革兰氏阳性菌、阴性菌、酵母及病毒均有杀灭和抑制作用。氯化三苯基四氮唑(TTC)易溶于水，具有被丝状真菌细胞内脱氢酶还原后生成红色的三苯基甲臢(Triphenyl formazan，TF)的特性，也可通过与细胞内脱饱和酶的活性的氧化还原反应生成红色的TF来直观体现，进而可以初步判定细胞内脱氢酶和脱饱和酶的活性。因此氯化三苯基四氮唑(TTC)可以根据反应前后丝状颜色转化速度及颜色深浅的不同作为筛选产油丝状真菌的指示剂。

因此在含有三氯生和氯化三苯基四氮唑(TTC)的PDA培养基中，能够正常生长的菌种是油脂量占生物量的较大百分比的丝状真菌。本发明结合使用指示剂TTC及抗性筛选因子三氯生，建立了一种新的筛菌策略，能够快速、高效地从土样中筛选高产PUFAs的丝状真菌，旨在为基础研究和商业化生产油脂提供良好的出发菌株。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种筛选产油丝状真菌的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种适用于产油丝状真菌的氯化三苯基四氮唑PDA培养基，其包括，配置马铃薯琼脂培养基；加入三氯生和氯化三苯基四氮唑，使得马铃薯琼脂培养基含有5mg/L三氯生和0.5g/L氯化三苯基四氮唑。