[发明专利]一种高效液相色谱串联质谱法测定神经甾体类激素的方法

说明书

本发明公开了一种高效液相色谱串联质谱法测定神经甾体类激素的方法，涉及动物体外激素测定方法领域。其方法包括以下步骤：称取神经甾体标准品配制成标准溶液；取待测样品，称重后加入乙腈和MT，涡旋并离心，取上清液，将上清液加入至预先用乙腈清洗过的EMR固相萃取小柱中过滤，得净化后的样品溶液；利用高效液相色谱‑串联质谱仪分别对标准溶液和样品溶液进行检测分析。本发明通过乙腈沉淀蛋白提取后过EMR小柱的方法去除蛋白等干扰成分，解决AP的标准溶液不成线性，响应极低的问题；同时使得测定的各神经甾体具有较好的回收率。

技术领域

本发明涉及动物体外激素测定方法，具体涉及一种高效液相色谱串联质谱法测定神经甾体类激素的方法。

背景技术

神经甾体是指在神经系统中合成的甾体和经血脑屏障进入神经系统发挥作用的外周甾体及其代谢衍生物。这些神经甾体可以通过结合不同的神经受体(如GABAA，Sigma受体)调控神经功能。神经甾体的行为与中枢神经系统正常功能的行使密切相关。研究表明，在不同的生理和病理条件下，神经甾体在各个脑区中的含量会显著变化。神经甾体还会参与焦虑和抑郁的调节过程。由于神经甾体在生物体内含量极低，基质干扰多，使得生物体内内源性神经甾体的测定十分困难，因而开发快速、准确检测生物体内神经甾体含量的方法就显得尤为重要。

传统的神经甾体的检测方法有放射免疫标记法(RIA)和气相色谱质谱联用法(GC-MS)，但放射免疫标记法特异性差，且存在安全隐患；气相色谱-质谱联用法虽然灵敏度高，但样品前处理步骤复杂，不能实现高通量分析。

现有技术中，有使用高效液相色谱-三重四级杆/复合线性离子阱质谱，并以甲基睾酮为内标的检测方法快速、同时测定大鼠不同脑区中神经甾体的含量(刘佳，张朦，万有等.高效液相色谱-三重四级杆/复合线性离子阱质谱测定鼠脑组织中神经甾体类化合物[J].分析化学,2015,43(08):1118-1124.)；

但发现，根据前述文献的方法试验时发现AP(别孕烯醇酮)的标准溶液不成线性，响应极低；且PREG(孕烯醇酮)和PROG(孕酮)基质效应明显；同时第一次回收率试验结果一般。因此需要考虑改进测定过程中的部分步骤以提高其回收率。

发明内容

本发明针对上述现有技术存在的问题，目的是提供一种高效液相色谱串联质谱法测定神经甾体类激素的方法。

为实现本发明的目的，通过以下技术方案予以实现：

一种高效液相色谱串联质谱法测定神经甾体类激素的方法，包括以下步骤：

(1)标准溶液的配制：称取神经甾体标准品配制成标准溶液；

(2)样品前处理：取待测样品，称重后加入乙腈和MT，涡旋并离心，取上清液；将上清液加入至预先用乙腈清洗过的EMR固相萃取小柱中过滤，得净化后的样品溶液；

(3)高效液相色谱-串联质谱分析：利用高效液相色谱-串联质谱仪分别对标准溶液和样品溶液进行检测分析。

优选地，步骤(3)中，高效液相色谱条件为：

XDB-C₁₈色谱柱；流动相A为乙酸铵溶液，流动相B为甲醇；采用梯度洗脱模式：

0-2.5min时，流动相A:流动相B＝40％:60％

2.5-5.5min时，流动相A:流动相B＝40％:60％-60％:95％

5.5-7.0min时，流动相A:流动相B＝5％:95％

7.0-7.1min时，流动相A:流动相B＝5％:40％-95％:60％

7.1-10.0min时，流动相A:流动相B＝40％:60％

流速0.5mL/min,进样体积10μL,柱温45℃。