[发明专利]重组PAGE4蛋白在提高绵羊体外胚胎囊胚率的应用方法

权利要求书

1.重组PAGE4 蛋白在提高绵羊体外胚胎囊胚率的应用方法，该应用方法包括步骤如下：

（1）获取当日宰杀绵羊的卵巢，置入温度在30-35℃，含1000 IU/ml青霉素和1000 IU/mL链霉素的生理盐水中，3-5小时内带回实验室，用生理盐水清洗3-4次；

（2）用吸有2 mL抽卵液的注射器抽吸卵巢表面2-5 mm大小的卵泡，将注射器内回收的卵泡液置于器皿中，在显微镜下捡出卵母细胞，用体外成熟液洗涤3-5次，加入到添加了重组PAGE4蛋白的体外成熟液中，在条件为5% CO₂，95%空气，温度为38.6 ℃的CO₂培养箱内培养22-24小时；

（3）将步骤（2）中得到的卵母细胞，用绵羊体外受精液洗涤2-4次，按25-30枚/滴的密度加入装有体外受精液的液滴内，备用；

（4）将解冻后的冻精，加入装有体外受精液的试管底部，CO₂培养箱中上游20-25分钟，取上层精子混悬液，以1500 转/分钟的转速离心4-5分钟，然后弃去上清液，用剩余的精子沉淀进行密度计算，按2-4×10⁶ 个/mL的密度加入步骤（3）的体外受精液滴中与卵母细胞共同孵育；

（5）将步骤（4）中受精20-22小时的早期胚胎取出，在体外培养液IVC内洗涤3-4次，并在体外培养液中培养24-26小时，将未卵裂的卵母细胞挑出，统计卵裂率，继续培养144-168小时后统计囊胚率。

2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于：所述重组PAGE4蛋白的制备如下：

将已构建好的含有PAGE4蛋白基因PAGE4的重组质粒pET28a-PAGE4转化Escherichia coli BL21，转化菌在0.2 mM IPTG诱导下表达融合蛋白，经SDS-PAGE分析表明重组蛋白PAGE4在Escherichia coli BL21中以包涵体形式高效表达；菌体超声裂解的沉淀经2%TritonX-100、0.2% 脱氧胆酸和2 M尿素洗涤后，溶解于8 M脲中经Ni-NTA亲和层析纯化后，洗脱缓冲液超滤后替换成TGE缓冲液再次洗脱并保存，其中所述的TGE缓冲液配比为50 mMTris-HCl、0.5 mM EDTA、50 mM NaCl以及5% 甘油，并调整pH值为8.0；纯化后的His- PAGE4经过SDS-PAGE鉴定为重组PAGE4蛋白。

3. 根据权利要求1或2所述的应用方法，其特征在于：所述的重组PAGE4蛋白浓度为160ng/mL。