[发明专利]重组PAGE4蛋白在提高绵羊体外胚胎囊胚率的应用方法

说明书

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及重组PAGE4蛋白在提高绵羊体外胚胎囊胚率的应用方法，该应用方法包括步骤如下：（1）获取当日宰杀绵羊的卵巢；（2）抽吸卵巢表面2‑5mm大小的卵泡进行培养；（3）将卵母细胞加入体外受精液的液滴内，备用；（4）体外受精液滴中与卵母细胞共同孵育；（5）统计卵裂率，继续培养144‑168小时后统计囊胚率。通过在绵羊体外成熟培养液中添加重组PAGE4蛋白，能显著提高绵羊体外胚胎的囊胚率。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及重组PAGE4 蛋白在提高绵羊体外胚胎囊胚率的应用方法，具体属于重组PAGE4 蛋白的新用途发明。

背景技术

PAGE4（Prostate-associated gene 4）基因属于PAGE家族（PAGE family member4），通常在大多数体细胞组织中沉默，而在雄性和雌性动物的睾丸、输卵管、子宫和胎盘等生殖细胞中表达。该基因也是癌症/睾丸抗原（Cancer/Testis Antigen，CTA）基因家族的成员，近年来发现其也在一些肿瘤中特异表达，尤其是在前列腺癌（PCa）中，还包括良性前列腺增生（BPH）的基质和前列腺癌前体的增生性炎性萎缩（PIA）上皮。还有研究发现，前列腺癌组织中 PAGE4的转录水平与癌症的生物复发呈负相关，提示PAGE4可能是前列腺癌恶性程度的辅助指标。但目前还没有将PAGE4用于绵羊体外胚胎的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于：在绵羊体外胚胎囊胚成熟培养过程中，利用重组PAGE4蛋白对绵羊卵母细胞进行处理，找到一种可以显著提高绵羊体外胚胎囊胚率的方法。

实现本发明的目的技术方案如下：重组PAGE4 蛋白在提高绵羊体外胚胎囊胚率的应用方法，该应用方法包括步骤如下：

（1）获取当日宰杀绵羊的卵巢，置入温度在30-35℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/mL链霉素的生理盐水中，3-5小时内带回实验室，用生理盐水清洗3-4次；

（2）用吸有2mL抽卵液的注射器抽吸卵巢表面2-5mm大小的卵泡，将注射器内回收的卵泡液置于器皿中，在显微镜下捡出卵母细胞，用体外成熟液洗涤3-5次，加入到添加了重组PAGE4蛋白的体外成熟液中，在条件为5% CO₂，95%空气，温度为38.6 ℃的CO₂培养箱内培养22-24小时；

（3）将步骤（2）中得到的卵母细胞，用绵羊体外受精液洗涤2-4次，按25-30枚/滴的密度加入装有体外受精液的液滴内，备用；

（4）将解冻后的冻精，加入装有体外受精液的试管底部，CO₂培养箱中上游20-25分钟，取上层精子混悬液，以1500 转/分钟的转速离心4-5分钟，然后弃去上清液，用剩余的精子沉淀进行密度计算，按2-4×10⁶ 个/mL的密度加入步骤（3）的体外受精液滴中与卵母细胞共同孵育；

（5）将步骤（4）中受精20-22小时的早期胚胎取出，在体外培养液IVC内洗涤3-4次，并在体外培养液中培养24-26小时，将未卵裂的卵母细胞挑出，统计卵裂率，继续培养144-168小时后统计囊胚率。

进一步设计，所述重组PAGE4蛋白的制备如下：