[发明专利]生物催化合成L-4-Cl-犬尿氨酸或L-4-Br-犬尿氨酸的方法及应用

说明书

本发明属于生物技术和发酵领域，具体公开了生物催化合成L‑4‑Cl‑犬尿氨酸或L‑4‑Br‑犬尿氨酸的方法及应用。本发明以廉价易得的6‑Cl/Br‑吲哚和L‑丝氨酸为底物，在Pf0A9酶和Tar13酶的串联催化下一步合成L‑4‑Cl/Br‑犬尿氨酸。同时通过构建Pf0A9‑Tar13双基因表达质粒，成功实现了L‑4‑Cl/Br‑犬尿氨酸的发酵生产。与之前已报道的有机和生物合成方法相比，本发明所构建的生物合成通路不仅降低了合成过程中所用酶的数量，而且还能应用于发酵生产，因此更加经济环保，具有很大的市场开发价值。

技术领域

本发明属于生物技术和发酵领域，具体涉及生物催化合成L-4-Cl-犬尿氨酸或L-4-Br-犬尿氨酸的方法及应用。

背景技术

通过N-甲基-D-门冬氨酸受体(N-methyl-d-aspartate receptors，简称NMDARs)介导的谷氨酸能突触传递过度活跃是造成中枢敏化和持续的神经性疼痛的一个重要原因，目前为实现对N-甲基-D-门冬氨酸受体的阻断，除了使用氯胺酮等这类直接受体拮抗剂，还可通过对N-甲基-D-门冬氨酸受体复合物中的甘氨酸协同激动剂变构位点进行阻断来实现。其中，7-氯犬尿喹啉酸(7-chlorokynurenic acid)是最具药效和专一的甘氨酸(glycine B，GlyB)协同激动剂变构位点拮抗剂之一，但由于其较差的生物可用度而不能直接作为药物来用于治疗神经性疼痛。相比之下，L-4-氯犬尿氨酸(L-4-chlorokynurenine)作为7-氯犬尿喹啉酸的前体药物，不仅可以通过口服后快速被肠道吸收，并且能被大型神经氨基酸转运体通过主动运输穿越血脑屏障送达大脑神经部位。在大脑内，星形胶质细胞里的犬尿氨酸氨基转移酶(kynurenine aminotransferases，KATs)会将L-4-氯犬尿氨酸转化为7-氯犬尿喹啉酸，然后释放并作用于神经元GlyB位点来进行N-甲基-D-门冬氨酸受体的间接拮抗阻断。综上，L-4-氯犬尿氨酸可以作为前体药物来治疗由N-甲基-D-门冬氨酸受体过度兴奋引起的神经性疼痛疾病。

目前，L-4-氯犬尿氨酸的合成基本都是由有机合成方法来实现。但是目前的有机合成需要使用超低温等极端反应条件来进行合成，限制了其大规模合成，也造成了其造价成本较高。此外，L-4-氯犬尿氨酸类似物药物的研发也受到其类似物合成供应的制约，阻碍了其药物优化的研发进程。

本申请从目标产物的化学结构出发，通过从头设计其生物合成通路，将其原来的5步生物合成骤缩减至2步生物催化反应，大大提升目标产物的生产效率和产量。原来的生物合成L-4-氯犬尿氨酸需要5步生物合成的步骤，总共需要Tar14、Tar15、PtdH、Tar13、Tar16这5个蛋白完成L-4-氯犬尿氨酸的生物合成(Angew.Chem.Int.Ed.2019,58,8394–8399)。

目前尚无利用我们所提出的两步生物合成L-4-氯犬尿氨酸以及更高效的L-4-氯犬尿氨酸类似物等治疗神经性疼痛药物的相关报道。本申请为大规模生产L-4-氯犬尿氨酸以及更高效的L-4-氯犬尿氨酸类似物等治疗神经性疼痛药物提供一种新的高效方法。

发明内容

本发明的目的在于提供了生物催化合成L-4-Cl-犬尿氨酸或L-4-Br-犬尿氨酸的方法，方法简单，适合大规模推广。

本发明的另一个目的在于提供了上述方法在制备L-4-Cl-犬尿氨酸或L-4-Br-犬尿氨酸中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种生物催化合成L-4-Cl-犬尿氨酸或L-4-Br-犬尿氨酸的方法，包括以6-Cl-吲哚或6-Br-吲哚和L-丝氨酸为底物，Pf0A9酶和Tar13酶为催化剂进行催化反应后，加酸溶液进一步反应，提纯即得。