[发明专利]一种基于不可逆电穿孔技术的肝脏脱细胞支架构建方法

说明书

本发明涉及一种基于不可逆电穿孔技术的肝脏脱细胞支架构建方法。该方法包括以下步骤：1.1)大鼠称重，以异氟烷进行气体吸入麻醉并维持，麻醉生效后，SD大鼠仰卧位，用75％酒精消毒腹部皮肤，分层开腹暴露肝脏；1.2)应用卡钳式电极夹起大鼠肝脏左外叶区域，给予高压脉冲电场处理；1.3)不可逆电穿孔处理结束后，经大鼠门静脉进行插管，用肝素化PBS液进行灌注，同时剪开肝下下腔静脉，见肝脏充盈且颜色逐渐变浅，逐渐游离肝脏周围组织及韧带，取下肝脏浸入肝素化PBS液中；1.4)将取下的肝脏放入洁净容器内，用去离子水进行单向灌注；1.5)去离子水灌注结束后，PBS单向灌注30min，完成支架制备。本发明能在不应用有害化学制剂的情况下，有效提升体外脱细胞支架的构建效率。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种基于不可逆电穿孔技术的肝脏脱细胞支架构建方法。

背景技术

近年来，运用组织工程的方法制备脱细胞器官基质支架，保留器官完整的细胞外基质成分和天然血管管道系统，并以此构建功能化器官解决器官严重短缺的问题，是组织工程研究中的新的突破口和热点。目前，生物脱细胞支架已成功应用于同种或异种供体膀胱、食管、气管、皮肤、心脏瓣膜、以及心、肝、肺等组织器官的修复重建研究及临床应用。2008年HaraldCOtt团队首次报道了大鼠心脏脱细胞支架，并构建出具有一定功能的离体心脏组织，成为组织工程领域脱细胞构建组织器官的里程碑。此后又陆续成功建立了肺脏、肝脏等复杂实质器官的脱细胞支架，并基于这些脱细胞支架构建了具有一定功能的组织工程器官。在2015年HaraldCOtt团队使用人类心脏脱细胞支架构建出具有搏动功能的人工心脏，为组织工程构建临床可用的生物人工器官向前推进了一大步。

细胞外基质成分是组织细胞的分泌产物，在支持连接组织结构、调节组织发生及细胞生理活动等方面有着重要作用。一方面，细胞外基质能够影响细胞的生存和死亡，并调控细胞的形态及功能状态；另一方面，细胞外基质成分还参与细胞的增殖、迁移及分化过程。在组织及器官移植中，细胞膜表面抗原及特异性蛋白是组织免疫排斥反应发生的主要原因，而细胞外基质在进化上则相对保守，在不同种属间具有很大程度的同源性。组织脱细胞的目的就是有效去除细胞和细胞成分的DNA、蛋白质等抗原物质，保留结构较为稳定的惰性物质及细胞外基质的三维超微机构，很大程度上保留组织再细胞化微环境并降低移植物排斥反应的发生。

目前常用的脱细胞技术主要包括物理方法目前常用的脱细胞技术主要包括物理方法、化学方法、酶消化法等。物理方法脱细胞的原理主要是使细胞膜破裂，利用物理手段从组织中清除细胞内容物，代表性技术主要有反复冻融、超声波降解、物理搅拌以及加压脱细胞等。这种方法对细胞外基质结构影响不大，但需要的时间与组织器官的大小、成分及密度等密切相关，往往耗时久而效果差，很少单独使用。化学脱细胞方法原理主要是利用酸性、碱性、高低渗透压溶液以及最常用的离子型与非离子型去污剂等破坏细胞成分，脱除组织中的细胞抗原、可溶性蛋白质和氨基糖等，仅仅保留原组织器官中的胶原纤维、弹性蛋白、氨基多糖和结构蛋白等。目前，化学脱细胞方法应用最为广泛，但是存在去污剂残留的问题。酶学脱细胞方法主要使用的消化酶有胰蛋白酶、核酸酶以及脂肪酶等。该方法脱细胞效果尚不确定，并会对细胞外基质产生较多的破坏，并未被广泛使用。因此，进行脱细胞支架构建方法的创新，在提高脱细胞效率的同时，降低对支架成分的损伤并尽可能减少有毒化学物质的使用或残留具有重要的意义。

不可逆电穿孔技术是应用高压脉冲电场作用于细胞，导致细胞膜产生不可恢复的纳米级孔道，破坏细胞内环境的稳态，进而导致细胞凋亡或坏死。目前，该技术已经在肿瘤消融治疗中进行了应用。其相比于传统消融技术，具有不依靠热效应不损伤细胞外基质成分的特点，因此，该技术也有望作为一种新的脱细胞方法。Phillips等应用不可逆电穿孔技术进行了兔颈动脉脱细胞实验，结果显示处理后3d可以实现组织细胞脱除而血管壁支架结构仍然完整。但在该研究中，研究者主要利用机体自身的免疫应答实现脱细胞，反应耗时长且仅能在体进行，限制了其应用范围。

发明内容