[发明专利]肠道病毒核酸检测的通用引物和探针以及试剂盒

说明书

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种肠道病毒核酸检测的通用引物和探针以及试剂盒。本发明根据肠道病毒5‘UTR序列新的突变位点设计引物及荧光探针，本发明提供的肠道病毒的通用型核酸检测的引物、探针简并性强，其在上游引物的3’端起8碱基处引入兼并碱基；下游引物5’端16碱基处根据T碱基突变引入兼并碱基。采用本发明引物及探针进行rRT‑PCR检测，对肠道病毒5‘UTR序列突变产生的新型肠道病毒具有较高的检出率，灵敏度高；为肠道病毒感染的相关疾病诊断提供科学依据。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种肠道病毒核酸检测的通用引物和探针以及试剂盒。

技术背景

肠道病毒属于小RNA病毒家族，肠道病毒属内能够感染人的有4个种：分别为A、B、C和D。根据遗传及表型的相似性肠道病毒又进一步划分为多个血清型，截至目前有超过 110个血清型。肠道病毒在基因组复制过程易产生错误，随着时间的累积而发生突变。肠道病毒之间的重组现象非常普遍，重组又进一步增加的遗传的多样性，同时也为临床诊断带来了困难。

通过Real-time RT-PCR (rRT-PCR)方法对肠道病毒型别进行鉴定，能够在较短时间内对疑似感染样本进行确诊，应用于临床标本检测时，可用于肠道病原监测以及临床流行病学研究。但因病毒的变异为引物、探针设计带来困难，为准确对流行中的肠道病毒进行鉴定，需要定期对流行毒株的序列进行比对和分析。如分型鉴定引物探针不再适用于流行的毒株，则需要对引物、探针序列进行更新优化。随着新的肠道病毒血清型的发现和肠道病毒5‘UTR区产生新的突变位点被发现，为提高检测的灵敏度和特异度，需根据新的突变位点设计新的引物。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种肠道病毒核酸检测的通用引物和探针以及试剂盒。采用本发明的引物、探针或试剂盒及其他常规试剂组分，能够实现针对肠道病毒5’UTR新突变位点的PCR检测。

根据本发明的第一个方面，本发明提供一种用于肠道病毒的通用核酸检测的引物、探针序列，包括有核苷酸序列如SEQ ID No:1所示的上游引物，核苷酸序列如SEQ IDNo:2所示的下游引物，以及核苷酸序列如SEQ ID No:3所示的探针，所述探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。优选的，所述探针的5’端标记有 FAM 荧光染料，3’端标记有TAMRA 荧光染料。

根据本发明的第二个方面，本发明提供一种肠道病毒的通用核酸检测的试剂盒，本发明所述的试剂盒包含有检测引物，检测探针；所述的检测引物的序列如如 SEQ ID No:1 和 SEQ ID No:2 所示；所述探针的核苷酸序列如 SEQ ID No:3 所示，该探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料，作为优选的，上述探针的5’端标记有 FAM荧光染料，3’端标记有TAMRA 荧光染料。

上述试剂盒还包括核苷酸序列如SEQ ID No:4所示的阳性对照质粒。所述阳性对照质粒是登录号为的JN048468的人柯萨奇病毒B3，Nancy株多蛋白序列。

上述试剂盒还包括有rRT-PCR 反应液，所述rRT-PCR 反应液与上述引物、探针共同构成rRT-PCR 检测体系。

所述rRT-PCR 检测体系含有以下含量的各组分：25μl rRT-PCR 检测体系中含有：2×OneStep RT-PCR Buffer 12.5μl，10μM正向引物3.0μl，10μM反向引物 3.0μl，10μM探针0.5μl，Rox Reference Dye Ⅱ (50×)0.5μl，5U/μl Ex Taq HS 0.5μl，40U/μlPrimeScript RT enzyme Mix 0.5μl，RNA 4.5μl。

进一步的，上述试剂盒的检测反应条件：50℃反转录20min，95℃反应3min，95℃变性15s，60℃退火/延伸40s，PCR扩增反应45个循环。