[发明专利]鸡球虫多价重组蛋白疫苗及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种鸡球虫多价重组蛋白疫苗，其特征在于，包含4种鸡球虫重组蛋白：柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白41、柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白22、巨型艾美耳球虫配子体蛋白56、和堆型艾美耳球虫裂殖子蛋白Ea3-1E，所述4种鸡球虫重组蛋白均为原核表达，依次具有如SEQ IDNO.1-4所示的氨基酸序列，并按照1:1:1:1的质量比例混合。

2.如权利要求1所述的鸡球虫多价重组蛋白疫苗，其特征在于，所述4种鸡球虫重组蛋白依次具有如SEQ ID NO.5-8所示的核苷酸序列。

3.用于扩增权利要求2所述的核苷酸序列的引物，其特征在于，具有以下序列：

扩增EtROP41上游引物：

5’-TTCCAGGGGCCCCTGGGATCCGAACCTCCCCGAGTCAACCT-3’(SEQ ID NO.9)，

扩增EtROP41下游引物：

5’-CACGATGCGGCCGCTCGAGATCCTGGAACTCCCTGGACACC-3’(SEQ ID NO.10)；

扩增EtGAM22上游引物：

5’-CAAGGCCATGGCTGATATCGGCACCTGAGTATCCTTCTCAGCTTG-3’(SEQ ID NO.11)，

扩增EtGAM22下游引物：

5’-TTGTCGACGGAGCTCGAATTGTTGATGTCGGTAGGCTGCTCTTCC-3’(SEQ ID NO.12)；

扩增EmGAM56上游引物：

5’-TTCCAGGGGCCCCTGGGATCCCAGGTTCACCCTTACAGCGAG-3’(SEQ ID NO.13)，

扩增EmGAM56下游引物：

5’-CGTCTCCGCTCTTTGGCAACCTCGAGCGGCCGCATCGTG-3’(SEQ ID NO.14)；

扩增Ea3-1E上游引物：

5’-AGCAAATGGGTCGCGGATCCATGGGTGAAGAGGCTGATAC-3’(SEQ ID NO.15)，

扩增Ea3-1E下游引物：

5’-TCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGAAGCCGCCCTGGTACAGGT-3’(SEQ ID NO.16)。

4.一种鸡球虫多价重组蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

基因扩增：分别以柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白41、柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白22、巨型艾美耳球虫配子体蛋白56、和堆型艾美耳球虫裂殖子蛋白Ea3-1E的cDNA序列为模板，通过权利要求3所述的引物分别进行基因扩增；

重组载体构建：将扩增出的EtROP41基因序列与pGEX-6p-1骨架构建重组载体，将扩增出的EtGAM22基因序列与pET-28a骨架构建重组载体，将扩增出的EmGAM56基因序列与pGEX-6p-1骨架构建重组载体，将扩增出的Ea3-1E基因序列与pET-28a骨架构建重组载体；

重组蛋白表达：将上述4种重组载体分别转化表达菌，通过IPTG分别进行诱导表达、纯化；以及

混合：将诱导表达完成的4种鸡球虫重组蛋白进行等质量混合，即得。

5.如权利要求4所述的鸡球虫多价重组蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，所述表达菌为E.coliTransetta(DE3)菌株；所述柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白41、柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白22、和堆型艾美耳球虫裂殖子蛋白Ea3-1E的诱导表达条件均为37℃诱导12h，所述巨型艾美耳球虫配子体蛋白56的诱导表达条件为18℃诱导18h。

6.一种能够与权利要求1所述的鸡球虫多价重组蛋白疫苗特异性结合的抗体或血清。

7.权利要求1所述的鸡球虫多价重组蛋白疫苗在鸡球虫母源免疫以及制备治疗后代雏鸡抗球虫药物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述鸡球虫多价重组蛋白疫苗与佐剂共同使用，所述鸡球虫多价重组蛋白疫苗与佐剂为等质量混合。