[发明专利]整合脑神经元单细胞形态和单细胞转录组信息的方法

说明书

本发明属于神经细胞分类领域，公开了一种整合脑神经元单细胞形态和单细胞转录组信息的方法，是先对新鲜大脑目标脑区的神经元进行单细胞转录组分析，确定代表这些神经元细胞类型的独有标签基因；然后，对同种属、同性别、且同年龄大脑内相同目标脑区的神经元进行荧光标记并断层成像，得到各个脑片，获取这些神经元的单细胞形态；最后，取含有这些神经元胞体的脑片，通过标签基因原位杂交的介导，实现这些神经元单细胞形态和单细胞转录组信息的间接整合。本发明采用新思路，通过间接整合的流程设计，方法更加简单方便，为神经元细胞类型精准普查等，提供了重要的方法和技术支撑。

技术领域

本发明属于基础医学与生物技术中的神经细胞分类领域，更具体地，涉及一种整合脑神经元单细胞形态和单细胞转录组信息的方法，是一种基于单细胞的神经细胞分型研究方法，能够实现神经细胞的分类，适用于各种哺乳动物大脑。

背景技术

脑是脊椎动物最复杂的器官，是神经系统的中枢，直接或间接地控制着动物的几乎一切行为。神经元是大脑结构和功能的基本单元。人脑包含数以千亿计的神经元，即使像小鼠这样的小型哺乳动物，其大脑也包含上亿的神经元。数量如此多的大脑神经元，包含着成百上千的细胞类型。大脑神经元细胞类型普查，是当前脑科学研究的重大基础性问题之一。无论是欧洲的人脑计划还是美国脑计划，都将神经元细胞分类作为优先主攻任务。因为，大脑神经元的细胞分型，是一项非常重要的基础性工程，有利于人们理解大脑的工作机制，防治大脑神经疾病。

目前，神经元的细胞类型并没有严格的定义，一般是根据神经元的形态结构、分子表达、电生理特性等方面属性相似来确认归属为同一类神经元。早在1888年，卡哈尔提出了有关神经系统组成的神经元学说。通过染色方法看到单个神经元形态，人们开始知道大脑神经元有椎体细胞、颗粒细胞等。这种根据神经元细胞形态进行细胞分型的方法，发展最早也最为经典。之后发展了根据神经元电生理特性、蛋白质和RNA构成来分类研究神经元的方法。尤其是近年来，随着单细胞RNA测序技术的发展，单细胞转录组技术用于小鼠大脑皮层、下丘脑、纹状体、海马等脑区或核团的细胞分型，确定了神经元单细胞转录组和神经元功能存在较好的对应关系，显示出了良好的应用前景。因此，单细胞转录组用于神经元的细胞分型，越来越受到神经科学领域研究者的重视和认可。

转录组广义上是指特定细胞在某一功能状态下所有转录产物的集合，包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA以及其他各种非编码RNA。狭义上指所有信使RNA(mRNA)的集合。传统的转录组分析需要数万或数十万个细胞，这种基于细胞群体的方法将大量细胞的基因表达取平均值进行分析，无法揭示细胞之间基因表达的异质性。而本发明所说的单细胞转录组，就是在单细胞水平上，分析每一个单细胞的转录组mRNA信息。这种方法尤其适用于研究神经细胞这样高度异质性的细胞群体。

然而，传统方法根据神经元形态、电生理特性等单一维度信息进行细胞分类，具有较大的局限性。因为，这种分型非常不精确，不利于我们研究特定类型神经元的结构和功能。比如，根据单细胞基因表达信息，小鼠中脑多巴胺能神经元就包含至少6种神经元亚型，这些不同亚型神经元在轴突投射、帕金森病易感性上存在明显的差异，因此将之分成多种细胞类型更为合理。

值得一提的是，越来越多的研究者认识到，精确的神经元细胞分型，需要整合神经细胞形态投射、分子构成、电生理特性等多维度信息。2016年，Sten Linnarsson等将单细胞转录组信息和电生理数据整合起来，不仅发现了缩胆囊素神经元新的细胞亚型，也确定了不同细胞分型与电生理特性、对特定刺激的响应、神经递质受体表达存在密切的关系，为预测和研究这些不同亚型神经元的功能差异奠定了基础。